Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Toxoplasma gondii je intracelularni protozojski parazit koji modulira mikrookruženje zaraženog domaćina i poznato je da je povezan s incidencijom rasta tumora na mozgu.U ovoj studiji pretpostavljamo da egzosomalna miRNA-21 iz infekcije Toxoplasma potiče rast tumora mozga.Karakterizirani su egzosomi mikroglije BV2 zaražene toksoplazmom i potvrđena je internalizacija stanica glioma U87.Profili ekspresije egzosomalne mikroRNA analizirani su korištenjem nizova mikroRNA i mikroRNA-21A-5p povezanih s Toxoplasma gondii i razvrstavanjem tumora.Također smo istražili razine mRNA gena povezanih s tumorom u stanicama glioma U87 mijenjajući razine miR-21 u egzosomima i učinak egzosoma na proliferaciju stanica glioma U87.U egzosomima stanica glioma U87 inficiranih Toxoplasmom gondii, ekspresija mikroRNA-21 je povećana, a aktivnost antitumorskih gena (FoxO1, PTEN i PDCD4) smanjena.Egzosomi izvedeni iz BV2 inficirani toksoplazmom induciraju proliferaciju stanica glioma U87.Egzosomi induciraju rast stanica U87 u modelu mišjeg tumora.Predlažemo da povećani egzosomalni miR-21 u BV2 mikrogliji zaraženoj toksoplazmom može igrati važnu ulogu kao promotor rasta stanica u stanicama glioma U87 smanjivanjem antitumorskih gena.
Procjenjuje se da je u 2018. u svijetu dijagnosticirano više od 18,1 milijuna slučajeva uznapredovalog raka, s oko 297 000 tumora središnjeg živčanog sustava dijagnosticiranih svake godine (1,6% svih tumora)1.Prethodna istraživanja su pokazala da čimbenici rizika za razvoj tumora ljudskog mozga uključuju različite kemijske proizvode, obiteljsku povijest i ionizirajuće zračenje iz terapeutske i dijagnostičke opreme za glavu.Međutim, točan uzrok ovih zloćudnih bolesti nije poznat.Otprilike 20% svih karcinoma u svijetu uzrokovano je infektivnim uzročnicima, uključujući viruse, bakterije i parazite3,4.Infektivni patogeni ometaju genetske mehanizme stanice domaćina, poput popravka DNK i staničnog ciklusa, te mogu dovesti do kronične upale i oštećenja imunološkog sustava5.
Infektivni uzročnici povezani s ljudskim rakom najčešći su virusni patogeni, uključujući humane papiloma viruse i viruse hepatitisa B i C.Paraziti također mogu igrati potencijalnu ulogu u razvoju raka kod ljudi.Nekoliko vrsta parazita, naime Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis i Hymenolepis nana, upleteni su u razne vrste raka kod ljudi 6,7,8.
Toxoplasma gondii je unutarstanična protozoa koja regulira mikrookruženje zaraženih stanica domaćina.Procjenjuje se da ovaj parazit inficira otprilike 30% svjetske populacije, stavljajući cijelu populaciju u opasnost9,10.Toxoplasma gondii može zaraziti vitalne organe, uključujući središnji živčani sustav (SŽS), i uzrokovati ozbiljne bolesti kao što su smrtonosni meningitis i encefalitis, posebno kod pacijenata oslabljenog imuniteta9.Međutim, Toxoplasma gondii također može promijeniti okoliš zaraženog domaćina moduliranjem rasta stanica i imunoloških odgovora kod imunokompetentnih pojedinaca, što dovodi do održavanja asimptomatske kronične infekcije9,11.Zanimljivo je da s obzirom na korelaciju između prevalencije T. gondii i incidencije tumora mozga, neka izvješća sugeriraju da in vivo promjene okoliša domaćina zbog kronične infekcije T. gondii nalikuju tumorskom mikrookruženju.
Egzosomi su poznati kao međustanični komunikatori koji isporučuju biološki sadržaj, uključujući proteine ​​i nukleinske kiseline, iz susjednih stanica16,17.Egzosomi mogu utjecati na biološke procese povezane s tumorom kao što su anti-apoptoza, angiogeneza i metastaze u mikrookruženju tumora.Konkretno, miRNA (miRNA), male nekodirajuće RNA duljine oko 22 nukleotida, važni su posttranskripcijski regulatori gena koji kontroliraju više od 30% ljudske mRNA putem miRNA-induciranog kompleksa za utišavanje (miRISC).Toxoplasma gondii može poremetiti biološke procese kontrolirajući ekspresiju miRNA u zaraženim domaćinima.MiRNA domaćina sadrže važne signale za regulaciju bioloških procesa domaćina kako bi se postigla strategija preživljavanja parazita.Stoga nam proučavanje promjena u profilu miRNA domaćina nakon infekcije s T. gondii može pomoći da jasnije razumijemo interakciju između domaćina i T. gondii.Doista, Thirugnanam et al.15 sugerirali su da T. gondii potiče karcinogenezu mozga mijenjajući svoju ekspresiju na specifičnim miRNA domaćina povezanima s rastom tumora i otkrili su da T. gondii može uzrokovati gliome kod pokusnih životinja.
Ova studija usmjerena je na promjenu egzosomalne miR-21 u mikrogliji domaćina inficiranoj Toxoplasmom BV2.Uočili smo moguću ulogu promijenjenog egzosomalnog miR-21 u rastu stanica glioma U87 zbog zadržavanja u jezgri FoxO1/p27, koji je meta prekomjerno izraženog miR-21.
Egzosomi izvedeni iz BV2 dobiveni su diferencijalnim centrifugiranjem i potvrđeni različitim metodama kako bi se spriječila kontaminacija staničnim komponentama ili drugim vezikulama.Elektroforeza u SDS-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) pokazala je različite obrasce između proteina ekstrahiranih iz BV2 stanica i egzosoma (Slika 1A), a uzorci su procijenjeni na prisutnost Alixa, koji je analiziran Western blottingom markera egzosomalnih proteina u .Alix označavanje pronađeno je u proteinima egzosoma, ali ne i u proteinima lizata stanica BV2 (slika 1B).Dodatno, pročišćena RNA iz egzosoma izvedenih iz BV2 analizirana je pomoću bioanalizatora.18S i 28S ribosomske podjedinice rijetko su uočene u uzorku migracije egzosomske RNA, što ukazuje na pouzdanu čistoću (Slika 1C).Naposljetku, transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je da su promatrani egzosomi bili veličine oko 60-150 nm i da su imali strukturu sličnu šalici tipičnu za morfologiju egzosoma (Sl. 1D).
Karakterizacija egzosoma izvedenih iz BV2 stanica.(A) Stranica sigurnosno-tehničkog lista.Proteini su izolirani iz BV2 stanica ili egzosoma izvedenih iz BV2.Obrasci proteina razlikuju se između stanica i egzosoma.(B) Western blot analiza egzosomalnog markera (Alix).(C) Procjena pročišćene RNA iz BV2 stanica i BV2 izvedenih egzosoma pomoću bioanalizatora.Stoga su 18S i 28S ribosomske podjedinice u BV2 stanicama rijetko nađene u egzosomskoj RNA.(D) Transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je da su egzosomi izolirani iz BV2 stanica negativno obojeni s 2% uranil acetata.Egzosomi su veličine otprilike 60-150 nm i imaju oblik čaše (Song i Jung, neobjavljeni podaci).
Stanična internalizacija egzosoma izvedenih iz BV2 u stanice ljudskog glioma U87 promatrana je pomoću konfokalne mikroskopije.PKH26 obilježeni egzosomi lokalizirani su u citoplazmi stanica U87.Jezgre su obojene s DAPI (slika 2A), što ukazuje da stanice domaćina mogu internalizirati egzosome izvedene iz BV2 i utjecati na okolinu stanica primatelja.
Internalizacija egzosoma izvedenih iz BV2 u stanice glioma U87 i egzosoma izvedenih iz BV2 zaraženih toksoplazmom RH izazvala je proliferaciju stanica glioma U87.(A) Egzosomi progutani stanicama U87 izmjereni konfokalnom mikroskopijom.Stanice glioma U87 inkubirane su s egzosomima obilježenim s PKH26 (crveno) ili bez kontrole 24 sata.Jezgre su obojene DAPI (plavo) i zatim promatrane pod konfokalnim mikroskopom (ljestvica: 10 μm, x 3000).(B) Proliferacija stanica glioma U87 određena je testom stanične proliferacije.Stanice glioma U87 tretirane su egzosomima navedeno vrijeme. *P < 0,05 dobiveno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobiveno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobiveno prema t-kriteriju Stjudenta. *P < 0,05 pomoću Studentovog t-testa. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, dobiveno pomoću t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 dobiveno pomoću Studentovog t-testa.
Nakon potvrde internalizacije egzosoma izvedenih iz BV2 u stanice glioma U87, proveli smo testove stanične proliferacije kako bismo istražili ulogu egzosoma izvedenih iz toksoplazme BV2 u razvoju stanica ljudskog glioma.Tretiranje stanica U87 egzosomima iz stanica BV2 inficiranih T. gondii pokazalo je da egzosomi izvedeni iz BV2 inficirani T. gondii uzrokuju značajno veću proliferaciju stanica U87 u usporedbi s kontrolom (Slika 2B).
Osim toga, rast stanica U118 imao je iste rezultate kao U87, jer su egzosomi stimulirani toksoplazmom uzrokovali najviše razine proliferacije (podaci nisu prikazani).Na temelju ovih podataka možemo naznačiti da egzosomi zaraženi toksoplazmom izvedeni iz BV2 igraju važnu ulogu u proliferaciji stanica glioma.
Kako bismo istražili učinak egzosoma izvedenih iz BV2 inficiranih toksoplazmom na razvoj tumora, ubrizgali smo stanice glioma U87 u gole miševe za model ksenografta i ubrizgali egzosome izvedene iz BV2 ili egzosome izvedene iz BV2 inficirane RH.Nakon što su tumori postali vidljivi nakon 1 tjedna, svaka eksperimentalna skupina od 5 miševa podijeljena je prema veličini tumora kako bi se odredila ista početna točka, a veličina tumora je mjerena 22 dana.
U miševa s modelom ksenografta U87, primijećena je značajno veća veličina i težina tumora u skupini egzosoma inficiranih RH-om izvedenom iz BV2 22. dana (Slika 3A,B).S druge strane, nije bilo značajne razlike u veličini tumora između skupine egzosoma dobivenih od BV2 i kontrolne skupine nakon liječenja egzosomima.Osim toga, miševi kojima su ubrizgane stanice glioma i egzosomi vizualno su pokazali najveći volumen tumora u skupini egzosoma izvedenih iz RH-inficiranih BV2 (slika 3C).Ovi rezultati pokazuju da egzosomi inficirani toksoplazmom izvedeni iz BV2 induciraju rast glioma u modelu mišjeg tumora.
Onkogeneza (AC) egzosoma izvedenih iz BV2 u mišjem modelu ksenografta U87.Veličina tumora (A) i težina (B) bile su značajno povećane u BALB/c golih miševa tretiranih RH-inficiranim egzosomima izvedenim iz BV2.BALB/c golim miševima (C) supkutano je ubrizgano 1 x 107 U87 stanica suspendiranih u Matrigel smjesi.Šest dana nakon injekcije, 100 μg egzosoma izvedenih iz BV2 tretirano je miševima.Veličina i težina tumora izmjerene su na naznačene dane, odnosno nakon žrtvovanja. *P < 0,05. *P < 0,05. *R < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *R < 0,05. *P < 0,05.
Podaci su pokazali da je 37 miRNA (16 s prekomjernom ekspresijom i 21 s smanjenom ekspresijom) povezanih s imunitetom ili razvojem tumora značajno promijenjeno u mikrogliji nakon infekcije sojem Toxoplasma RH (Slika 4A).Relativne razine ekspresije miR-21 među promijenjenim miRNA potvrđene su RT-PCR-om u stvarnom vremenu u egzosomima izvedenim iz BV2, egzosomima tretiranim stanicama BV2 i U87.Ekspresija miR-21 pokazala je značajno povećanje egzosoma iz BV2 stanica zaraženih s Toxoplasma gondii (RH soj) (Slika 4B).Relativne razine ekspresije miR-21 u stanicama BV2 i U87 porasle su nakon unosa promijenjenih egzosoma (slika 4B).Relativne razine ekspresije miR-21 u moždanim tkivima bolesnika s tumorom i miševa zaraženih Toxoplasma gondii (soj ME49) bile su veće nego u kontrolama (Slika 4C).Ovi rezultati koreliraju s razlikama između razina ekspresije predviđenih i potvrđenih mikroRNA in vitro i in vivo.
Promjene u ekspresiji egzosomalnog miP-21a-5p u mikrogliji inficiranoj s Toxoplasma gondii (RH).(A) Pokazuje značajne promjene u siRNA povezane s imunitetom ili razvojem tumora nakon infekcije T. gondii RH.(B) Relativne razine ekspresije miR-21 otkrivene su RT-PCR-om u stvarnom vremenu u egzosomima izvedenim iz BV2, egzosomima tretiranim s BV2 i stanicama U87.(C) Relativne razine ekspresije miR-21 pronađene su u moždanom tkivu pacijenata s tumorom (N=3) i miševa zaraženih Toxoplasma gondii (soj ME49) (N=3). *P < 0,05 dobiveno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobiveno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobiveno pomoću t-kriterija Stjudenta. *P < 0,05 dobiveno je pomoću Studentovog t-testa. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, dobiveno pomoću t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 dobiveno pomoću Studentovog t-testa.
Egzosomi iz RH-inficiranih BV2 stanica doveli su do rasta glioma in vivo i in vitro (Slika 2, 3).Kako bismo otkrili relevantne mRNA, ispitali smo razine mRNA antitumorskih ciljnih gena, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN i programirane stanične smrti 4 (PDCD4) u U87 stanicama zaraženim egzosomima izvedenim iz BV2 ili RH BV2.Bioinformatička analiza pokazala je da nekoliko gena povezanih s tumorom, uključujući gene FoxO1, PTEN i PDCD4, imaju miR-2121,22 vezna mjesta.Razine mRNA antitumorskih ciljnih gena smanjene su u RH-inficiranim egzosomima izvedenim iz BV2 u usporedbi s egzosomima izvedenim iz BV2 (slika 5A).FoxO1 je pokazao smanjene razine proteina u RH-inficiranim egzosomima izvedenim iz BV2 u usporedbi s egzosomima izvedenim iz BV2 (Slika 5B).Na temelju ovih rezultata, mogli bismo potvrditi da egzosomi izvedeni iz RH-inficiranog BV2 smanjuju anti-onkogene gene, zadržavajući svoju ulogu u rastu tumora.
Toxoplasma RH-inficirani BV2-izvedeni egzosomi induciraju supresiju antitumorskih gena u U87 gliomskim stanicama od strane Toxoplasma RH-inficiranih BV2-izvedenih egzosoma.(A) PCR u stvarnom vremenu ekspresije FoxO1, PTEN i PDCD4 u egzosomima izvedenim iz T. gondii RH-inficiranog BV2 u usporedbi s egzosomima PBS.Kao kontrola korištena je mRNA β-aktina.(B) Ekspresija FoxO1 određena je Western blotingom, a podaci denzitometrije statistički su procijenjeni pomoću programa ImageJ. *P < 0,05 dobiveno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobiveno je Studentovim t testom. *P < 0,05 dobiveno pomoću t-kriterija Stjudenta. *P < 0,05 dobiveno je pomoću Studentovog t-testa. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, dobiveno pomoću t-kriterija Stjudenta. * P < 0,05 dobiveno pomoću Studentovog t-testa.
Kako bi se razumio učinak miP-21 u egzosomima na regulaciju gena povezanu s tumorom, U87 stanice su transficirane inhibitorom miP-21 pomoću Lipofectamine 2000 i stanice su sakupljene 24 sata nakon transfekcije.Razine ekspresije FoxO1 i p27 u stanicama transfektiranim inhibitorima miR-21 uspoređene su sa stanicama tretiranim egzosomima izvedenim iz BV2 pomoću qRT-PCR (Slika 6A,B).Transfekcija inhibitora miR-21 u stanice U87 značajno je smanjila ekspresiju FoxO1 i p27 (Slika 6).
RH-inficirani egzosomalni miP-21 izveden iz BV2 promijenio je ekspresiju FoxO1/p27 u stanicama glioma U87.U87 stanice su transficirane s miP-21 inhibitorom pomoću Lipofectamine 2000 i stanice su sakupljene 24 sata nakon transfekcije.Razine ekspresije FoxO1 i p27 u stanicama transfektiranim inhibitorima miR-21 uspoređene su s razinama u stanicama tretiranim egzosomima izvedenim iz BV2 pomoću qRT-PCR (A, B).
Kako bi izbjegao imunološki odgovor domaćina, parazit Toxoplasma transformira se u tkivnu cistu.Oni parazitiraju u različitim tkivima, uključujući mozak, srce i skeletne mišiće, tijekom cijelog životnog vijeka domaćina i moduliraju imuni odgovor domaćina.Osim toga, mogu regulirati stanični ciklus i apoptozu stanica domaćina, potičući njihovu proliferaciju14,24.Toxoplasma gondii pretežno inficira dendritične stanice domaćina, neutrofile i monocitnu/makrofagnu lozu, uključujući moždanu mikrogliju.Toxoplasma gondii inducira diferencijaciju makrofaga fenotipa M2, utječe na cijeljenje rana nakon infekcije patogenom, a također je povezana s hipervaskularizacijom i granulomatoznom fibrozom.Ova bihevioralna patogeneza infekcije toksoplazmom može biti povezana s markerima povezanima s razvojem tumora.Neprijateljsko okruženje koje regulira Toxoplasma može nalikovati odgovarajućem prekancerozu.Stoga se može pretpostaviti da bi infekcija toksoplazmom trebala pridonijeti razvoju tumora mozga.Zapravo, zabilježene su visoke stope infekcije toksoplazmom u serumu pacijenata s različitim tumorima mozga.Osim toga, Toxoplasma gondii može biti još jedan kancerogeni efektor i djelovati sinergistički kako bi pomogao drugim infektivnim karcinogenima u razvoju tumora mozga.S tim u vezi, valja istaknuti da P. falciparum i Epstein-Barr virus sinergistički doprinose nastanku Burkittovog limfoma.
Uloga egzosoma kao regulatora u području istraživanja raka opsežno je istražena.Međutim, uloga egzosoma između parazita i zaraženih domaćina ostaje slabo shvaćena.Do sada su različiti regulatori, uključujući izlučene proteine, objasnili biološke procese kojima se protozojski paraziti odupiru napadu domaćina i održavaju infekciju.Nedavno je sve prisutniji koncept da mikrovezikule povezane s protozoama i njihove mikroRNA stupaju u interakciju sa stanicama domaćina kako bi stvorile povoljno okruženje za njihov opstanak.Stoga su potrebna daljnja istraživanja kako bi se otkrio odnos između promijenjenih egzosomalnih miRNA i proliferacije stanica glioma.MikroRNA alteracija (klaster gena miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 i miR-17-92) veže se za promotor STAT3 u ljudskim makrofagima zaraženim toksoplazmom, regulira se i inducira anti -apoptoza kao odgovor na infekciju Toxoplasma gondii 29 .Infekcija toksoplazmom povećava ekspresiju miR-17-5p i miR-106b-5p, koji su povezani s nekoliko hiperproliferativnih bolesti 30 .Ovi podaci sugeriraju da su miRNA domaćina regulirane infekcijom Toxoplasma važne molekule za preživljavanje parazita i patogenezu u biološkom ponašanju domaćina.
Promijenjene miRNA mogu utjecati na različite vrste ponašanja tijekom inicijacije i progresije malignih stanica, uključujući gliome: samodostatnost signala rasta, neosjetljivost na signale koji inhibiraju rast, izbjegavanje apoptoze, neograničen replikativni potencijal, angiogenezu, invaziju i metastaze te upalu.U gliomu su izmijenjene miRNA identificirane u nekoliko studija profiliranja ekspresije.
U ovoj studiji potvrdili smo visoke razine ekspresije miRNA-21 u stanicama domaćina zaraženim toksoplazmom.miR-21 je identificiran kao jedan od najčešće prekomjerno eksprimiranih mikroRNA u solidnim tumorima, uključujući gliome, 33 i njegova ekspresija korelira sa stupnjem glioma.Nagomilani dokazi sugeriraju da je miR-21 novi onkogen koji djeluje kao anti-apoptotski čimbenik u rastu glioma i izrazito je prekomjerno izražen u tkivima i plazmi malignih tumora ljudskog mozga.Zanimljivo je da inaktivacija miR-21 u stanicama i tkivima glioma pokreće inhibiciju stanične proliferacije zbog apoptoze ovisne o kaspazi.Bioinformatska analiza miR-21 predviđenih ciljeva otkrila je više gena supresora tumora povezanih s putevima apoptoze, uključujući programiranu staničnu smrt 4 (PDCD4), tropomiozin (TPM1), PTEN i forkhead box O1 (FoxO1), s veznim mjestom miR-2121..22.38.
FoxO1, kao jedan od transkripcijskih čimbenika (FoxO), uključen je u razvoj različitih tipova raka kod ljudi i može regulirati ekspresiju tumor supresorskih gena kao što su p21, p27, Bim i FasL40.FoxO1 može vezati i aktivirati inhibitore staničnog ciklusa kao što je p27 za suzbijanje rasta stanica.Štoviše, FoxO1 je ključni efektor PI3K/Akt signalizacije i regulira mnoge biološke procese kao što je napredovanje staničnog ciklusa i stanična diferencijacija kroz aktivaciju transkripcije p2742.
Zaključno, vjerujemo da egzosomalni miR-21 izveden iz mikroglije zaražene toksoplazmom može igrati važnu ulogu kao regulator rasta stanica glioma (slika 7).Međutim, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se pronašla izravna veza između egzosomalnog miR-21, promijenjene infekcije toksoplazmom i rasta glioma.Očekuje se da će ovi rezultati pružiti polazište za proučavanje odnosa između infekcije toksoplazmom i učestalosti glioma.
U ovoj studiji predložen je shematski dijagram mehanizma karcinogeneze glioma (mozga).Autor crta u programu PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Svi eksperimentalni protokoli u ovoj studiji, uključujući korištenje životinja, bili su u skladu sa standardnim etičkim smjernicama Odbora za brigu o životinjama i korisnika Nacionalnog sveučilišta u Seulu i odobreni su od strane Institucionalnog odbora za reviziju Medicinskog fakulteta Nacionalnog sveučilišta u Seulu (IRB broj SNU- 150715).-2).Svi eksperimentalni postupci provedeni su u skladu s preporukama ARRIVE.
Mišja mikroglija BV2 i stanice ljudskog glioma U87 uzgojene su u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM; Welgene, Seul, Koreja) i mediju Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), od kojih je svaki sadržavao 10% fetalnog goveđeg seruma, 4 mM l- glutamina, 0,2 mM penicilina i 0,05 mM streptomicina.Stanice su uzgajane u inkubatoru s 5% CO2 na 37°C.Druga linija stanica glioma, U118, korištena je za usporedbu sa stanicama U87.
Da bi se izolirali egzosomi iz RH i ME49 sojeva zaraženih T. gondii, tahizoiti T. gondii (RH soj) sakupljeni su iz trbušne šupljine 6-tjednih BALB/c miševa koji su ubrizgani 3-4 dana prije.Tahizoiti su isprani tri puta s PBS-om i pročišćeni centrifugiranjem u 40% Percollu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD)43.Da bi se dobili tahizoiti soja ME49, BALB/c miševima je intraperitonealno ubrizgano 20 tkivnih cista i tahizoitna transformacija u cistama je prikupljena ispiranjem trbušne šupljine 6-8. dana nakon infekcije (PI).Miševi zaraženi PBS-om.ME49 tahizoiti su uzgajani u stanicama s dodatkom 100 μg/ml penicilina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, SAD), 100 μg/ml streptomicina (Gibco/BRL) i 5% fetalnog goveđeg seruma (Lonza, Walkersville, MD) .., SAD) na 37 °C i 5% ugljičnog dioksida.Nakon uzgoja u Vero stanicama, ME49 tahizoiti su propušteni dva puta kroz iglu promjera 25, a zatim kroz filter od 5 µm kako bi se uklonili ostaci i stanice.Nakon ispiranja, tahizoiti su resuspendirani u PBS44.Tkivne ciste Toxoplasma gondii soja ME49 održavane su intraperitonealnim ubrizgavanjem cista izoliranih iz mozga zaraženih C57BL/6 miševa (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Koreja).Mozgovi miševa zaraženih ME49 sakupljeni su nakon 3 mjeseca PI i usitnjeni pod mikroskopom kako bi se izolirale ciste.Zaraženi miševi držani su u posebnim uvjetima bez patogena (SPF) na Medicinskom fakultetu Nacionalnog sveučilišta u Seulu.
Ukupna RNA ekstrahirana je iz egzosoma izvedenih iz BV2, stanica i tkiva BV2 pomoću miRNeasy Mini Kita (Qiagen, Hilden, Njemačka) u skladu s uputama proizvođača, uključujući vrijeme inkubacije za korak elucije.Koncentracija RNA određena je na spektrofotometru NanoDrop 2000.Kvaliteta RNA mikronizova procijenjena je pomoću bioanalizatora Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Nizozemska).
DMEM s 10% FBS-a siromašnog egzosomima pripremljen je ultracentrifugiranjem na 100 000 g tijekom 16 sati na 4 °C i filtriran kroz filter od 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, SAD).BV2 stanice, 5 × 105, uzgajane su u DMEM-u koji je sadržavao 10% FBS-a osiromašenog egzosoma i 1% antibiotika na 37°C i 5% CO2.Nakon 24 sata inkubacije, tahizoiti soja RH ili ME49 (MOI = 10) dodani su stanicama i neinvazivni paraziti su uklonjeni unutar jednog sata i ponovno napunjeni DMEM-om.Egzosomi iz stanica BV2 izolirani su modificiranim diferencijalnim centrifugiranjem, metodom koja se najčešće koristi.Resuspendirajte talog egzosoma u 300 µl PBS za analizu RNA ili proteina.Koncentracija izoliranih egzosoma određena je pomoću kompleta za analizu BCA proteina (Pierce, Rockford, IL, SAD) i spektrofotometra NanoDrop 2000.
Precipitati iz BV2 stanica ili egzosoma izvedenih iz BV2 lizirani su u PRO-PREP™ otopini za ekstrakciju proteina (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Koreja) i proteini su naneseni na Coomassie briljantno plavo obojene 10% SDS poliakrilamidne gelove.Osim toga, proteini su preneseni na PVDF membrane tijekom 2 sata.Western blotovi su potvrđeni korištenjem Alix antitijela (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, SAD) kao egzosomalnog markera.HRP-konjugirani kozji anti-mišji IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, SAD) i LAS-1000 plus luminiscentni analizator slike (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) korišteni su kao sekundarno antitijelo..Provedena je transmisijska elektronska mikroskopija za proučavanje veličine i morfologije egzosoma.Egzosomi izolirani iz BV2 stanica (6,40 µg/µl) pripremljeni su na mrežama obloženim ugljikom i negativno obojeni s 2% uranil acetatom tijekom 1 minute.Pripremljeni uzorci promatrani su na ubrzavajućem naponu od 80 kV pomoću JEOL 1200-EX II (Tokio, Japan) opremljenog ES1000W Erlangshen CCD kamerom (Gatan, Pleasanton, CA, SAD).
Egzosomi izvedeni iz BV2 obojeni su korištenjem PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) 15 minuta na sobnoj temperaturi.Stanice U87, 2×105, s PKH26-označenim egzosomima (crveno) ili bez egzosoma kao negativna kontrola, inkubirane su na 37°C 24 sata u inkubatoru s 5% CO2.Stanične jezgre U87 obojene su DAPI (plavo), stanice U87 fiksirane su u 4% paraformaldehidu 15 minuta na 4°C i zatim analizirane u Leica TCS SP8 STED CW konfokalnom mikroskopskom sustavu (Leica Microsystems, Mannheim, Njemačka).uočljiv.
cDNA je sintetizirana iz siRNA korištenjem Mir-X siRNA sinteze prvog lanca i SYBR qRT-PCR kompleta (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu proveden je upotrebom iQ5 sustava za detekciju PCR u stvarnom vremenu (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD) upotrebom početnica i šablona pomiješanih sa SYBR premixom.DNA je umnožena tijekom 40 ciklusa denaturacije na 95°C tijekom 15 s i žarenja na 60°C tijekom 60 s.Podaci iz svake PCR reakcije analizirani su korištenjem modula za analizu podataka softvera optičkog sustava iQ™5 (Bio-Rad).Relativne promjene u ekspresiji gena između odabranih ciljnih gena i β-aktina/siRNA (i U6) izračunate su korištenjem metode standardne krivulje.Korištene sekvence primera prikazane su u tablici 1.
3 x 104 stanica glioma U87 nasađeno je u ploče s 96 jažica i pomiješano s egzosomima zaraženim toksoplazmom izvedenim iz BV2 (50 μg/mL) ili nepulsnim egzosomima izvedenim iz BV2 (50 μg/mL) kao kontrolama nakon 12, 18 i 36 sati. .Stopa proliferacije stanica određena je korištenjem kompleta za brojanje stanica-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (dopunske slike S1-S3) 46 .
5-tjedne stare ženke golih miševa BALB/c kupljene su od Orient Bio (Seongnam-si, Južna Koreja) i držane pojedinačno u sterilnim kavezima na sobnoj temperaturi (22±2°C) i vlažnosti (45±15°C).%) pri sobnoj temperaturi (22±2°C) i vlažnosti (45±15%).12-satni ciklus svjetla i 12-satni ciklus tame izvedeni su pod SPF-om (Centar za životinje Medicinskog fakulteta Nacionalnog sveučilišta u Seulu).Miševi su nasumično podijeljeni u tri skupine od po 5 miševa i svim je skupinama supkutano ubrizgano 400 ml PBS-a koji je sadržavao 1 x 107 U87 stanica glioma i BD Matrigel™ sa smanjenim faktorom rasta (BD Science, Miami, FL, SAD).Šest dana nakon injekcije tumora, 200 mg egzosoma izvedenih iz stanica BV2 (sa/bez infekcije toksoplazmom) ubrizgano je u mjesto tumora.Dvadeset i dva dana nakon infekcije tumorom, veličina tumora miševa u svakoj skupini mjerena je kaliperom tri puta tjedno, a volumen tumora izračunat je po formuli: 0,5×(širina)×2×dužina.
Analiza ekspresije mikroRNA pomoću miRCURYTM LNA miRNA niza, 7. generacija ima, mmu i rno nizova (EXIQON, Vedbaek, Danska) koja pokriva 1119 dobro okarakteriziranih miševa među 3100 sondi za hvatanje miRNA ljudi, miševa i štakora.Tijekom ovog postupka, 250 do 1000 ng ukupne RNA uklonjeno je iz 5'-fosfata tretmanom s intestinalnom alkalnom fosfatazom nakon čega je slijedilo obilježavanje Hy3 zelenom fluorescentnom bojom.Označeni uzorci zatim su hibridizirani umetanjem stakalca s mikronizovima korištenjem kompleta hibridizacijske komore (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD) i kompleta hibridizacijskih stakalca (Agilent Technologies).Hibridizacija je provedena 16 sati na 56°C, zatim su mikronizovi isprani u skladu s preporukama proizvođača.Obrađena stakalca s mikromrežama zatim su skenirana korištenjem Agilent G2565CA sustava skenera s mikromrežama (Agilent Technologies).Skenirane slike uvezene su pomoću Agilent Feature Extraction softvera verzije 10.7.3.1 (Agilent Technologies), a intenzitet fluorescencije svake slike kvantificiran je pomoću odgovarajuće GAL datoteke modificiranog Exiqon protokola.Podaci mikronizova za trenutnu studiju pohranjeni su u GEO bazi podataka pod pristupnim brojem GPL32397.
Profili ekspresije zrelih egzosomalnih miRNA u mikroglijama RH ili ME49 sojeva zaraženih toksoplazmom analizirani su pomoću različitih mrežnih alata.miRNA povezane s razvojem tumora identificirane su pomoću miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) i filtrirane s normaliziranim intenzitetom signala (log2) većim od 8,0.Među miRNA, različito izražene miRNA pronađene su više od 1,5 puta promijenjene analizom filtera miRNA promijenjenih sojevima RH ili ME49 inficiranim s T. gondii.
Stanice su nasađene u ploče sa šest jažica (3 x 105 stanica/jažici) u opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, SAD) upotrebom Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD).Transfektirane stanice su uzgajane 6 sati i zatim je medij promijenjen u svježi potpuni medij.Stanice su sakupljene 24 sata nakon transfekcije.
Statistička analiza uglavnom je provedena korištenjem Studentovog t-testa s programom Excel (Microsoft, Washington, DC, SAD).Za eksperimentalnu analizu životinja, dvosmjerna ANOVA je provedena pomoću softvera Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SAD). P-vrijednosti < 0,05 smatrane su statistički značajnim. P-vrijednosti < 0,05 smatrane su statistički značajnim. Značenja P <0,05 smatrali su se statistički značajnim. P vrijednosti <0,05 smatrane su statistički značajnim. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Značenja P <0,05 smatrali su se statistički značajnim. P vrijednosti <0,05 smatrane su statistički značajnim.
Sve eksperimentalne protokole korištene u ovoj studiji odobrio je Institucionalni revizijski odbor Medicinskog fakulteta Nacionalnog sveučilišta u Seulu (IRB broj SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. i sur.Procijenjena globalna učestalost i smrtnost od raka u 2018.: izvori i metode GLOBOCAN-a.Tumačenje.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Uvid u čimbenike rizika od tumora mozga i njihove terapijske intervencije. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Uvid u čimbenike rizika od tumora mozga i njihove terapijske intervencije.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Pregled čimbenika rizika za tumore mozga i glavne terapijske intervencije. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Duboko razumijevanje faktora rizika za tumor mozga i terapijskih intervencija.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Pregled čimbenika rizika za tumore mozga i glavne terapijske intervencije.Biomedicinska znanost.ljekarnik.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijsko-virusne interakcije kod karcinoma orodigestivnog i ženskog genitalnog trakta kod ljudi: Sažetak epidemioloških i laboratorijskih dokaza. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijsko-virusne interakcije kod karcinoma orodigestivnog i ženskog genitalnog trakta kod ljudi: Sažetak epidemioloških i laboratorijskih dokaza.Kato I., Zhang J. i Sun J. Bakterijsko-virusne interakcije kod raka ljudskog gastrointestinalnog trakta i ženskog genitalnog trakta: sažetak epidemioloških i laboratorijskih podataka. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. 人类口腔消化道癌和女性生殖道癌中的细菌-病毒相互作用：流行病学和实验室证据总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterijsko-virusna interakcija u probavi ljudske usne šupljine i ženskom reproduktivnom traktu: sažetak popularne znanosti o bolestima i laboratorijskih dokaza.Kato I., Zhang J. i Sun J. Bakterijsko-virusne interakcije kod raka probavnog sustava kod ljudi i karcinoma ženskih spolnih organa: sažetak epidemioloških i laboratorijskih podataka.Rak 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Od infekcije do raka: Kako DNA tumorski virusi mijenjaju središnji metabolizam ugljika i lipida u stanici domaćina. Magon, KL & Parish, JL Od infekcije do raka: Kako DNA tumorski virusi mijenjaju središnji metabolizam ugljika i lipida u stanici domaćina.Mahon, KL i Parish, JL Vatrena infekcija do raka: kako tumorski virusi temeljeni na DNK mijenjaju središnji metabolizam ugljika i lipida u stanici domaćina. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNK 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Od infekcije do raka: kako DNK tumorski virusi mijenjaju središnji metabolizam ugljika i lipida u stanici domaćina.Mahon, KL i Parish, JL Infekcija izaziva rak: kako DNA tumorski virusi mijenjaju središnji metabolizam ugljika i lipida u stanicama domaćina.Otvorena biologija.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM i sur.Katehol estrogeni šistosoma i jetrenih metilja i raka povezanih s helmintima.ispred.vruće iznutra.5, 444 (2014).