Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Genski vektori za liječenje plućne cistične fibroze moraju biti usmjereni na provodne dišne ​​putove, budući da periferna plućna transdukcija nema terapeutski učinak.Učinkovitost virusne transdukcije izravno je povezana s vremenom zadržavanja nosača.Međutim, tekućine za isporuku kao što su prijenosnici gena prirodno difundiraju u alveole tijekom inhalacije, a terapeutske čestice bilo kojeg oblika brzo se uklanjaju mukocilijarnim transportom.Produljenje vremena zadržavanja nositelja gena u respiratornom traktu važno je, ali ga je teško postići.Magnetske čestice konjugirane s nosačem koje se mogu usmjeriti na površinu dišnog trakta mogu poboljšati regionalno ciljanje.Zbog problema sa slikanjem in vivo, ponašanje tako malih magnetskih čestica na površini dišnih putova u prisutnosti primijenjenog magnetskog polja slabo je poznato.Cilj ove studije bio je korištenje sinkrotronske slike za vizualizaciju in vivo kretanja niza magnetskih čestica u dušniku anesteziranih štakora kako bi se proučila dinamika i obrasci ponašanja pojedinačnih i skupnih čestica in vivo.Zatim smo također procijenili hoće li isporuka lentivirusnih magnetskih čestica u prisutnosti magnetskog polja povećati učinkovitost transdukcije u traheji štakora.Sinhrotronsko rendgensko snimanje pokazuje ponašanje magnetskih čestica u stacionarnim i pokretnim magnetskim poljima in vitro i in vivo.Čestice se pomoću magneta ne mogu lako povući po površini živih dišnih putova, ali se tijekom transporta naslage koncentriraju u vidnom polju, gdje je magnetsko polje najjače.Učinkovitost transdukcije također je povećana šest puta kada su lentivirusne magnetske čestice isporučene u prisutnosti magnetskog polja.Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da lentivirusne magnetske čestice i magnetska polja mogu biti vrijedni pristupi poboljšanju ciljanja genskih vektora i razina transdukcije u vodljivim dišnim putovima in vivo.
Cistična fibroza (CF) uzrokovana je varijacijama u jednom genu koji se naziva CF transmembranski regulator vodljivosti (CFTR).CFTR protein je ionski kanal koji je prisutan u mnogim epitelnim stanicama u cijelom tijelu, uključujući dišne ​​puteve, glavno mjesto u patogenezi cistične fibroze.Defekti CFTR-a dovode do abnormalnog transporta vode, dehidracije površine dišnih putova i smanjene dubine sloja tekućine na površini dišnih putova (ASL).Također smanjuje sposobnost mukocilijarnog transportnog sustava (MCT) da očisti dišne ​​putove od udahnutih čestica i patogena.Naš je cilj razviti lentivirusnu (LV) gensku terapiju za isporuku ispravne kopije CFTR gena i poboljšati ASL, MCT i zdravlje pluća, te nastaviti razvijati nove tehnologije koje mogu mjeriti te parametre in vivo1.
LV vektori su jedni od vodećih kandidata za gensku terapiju cistične fibroze, uglavnom zato što mogu trajno integrirati terapeutski gen u bazalne stanice dišnih putova (matične stanice dišnih putova).Ovo je važno jer oni mogu uspostaviti normalnu hidrataciju i čišćenje sluzi diferencijacijom u funkcionalne genski korigirane površinske stanice dišnih putova povezanih s cističnom fibrozom, što rezultira doživotnim dobrobitima.LV vektori moraju biti usmjereni protiv provodnih dišnih putova, jer tu počinje zahvaćenost pluća kod CF.Dostava vektora dublje u pluća može rezultirati alveolarnom transdukcijom, ali to nema terapeutski učinak kod cistične fibroze.Međutim, tekućine kao što su prijenosnici gena prirodno migriraju u alveole kada se udahnu nakon poroda3,4 i terapeutske čestice se brzo izbacuju u usnu šupljinu pomoću MCT-a.Učinkovitost LV transdukcije izravno je povezana s duljinom vremena u kojem vektor ostaje blizu ciljnih stanica kako bi se omogućio stanični unos - "vrijeme zadržavanja" 5 koje se lako skraćuje tipičnim regionalnim protokom zraka, kao i koordiniranim unosom sluzi i MCT čestica.Za cističnu fibrozu, sposobnost produljenja vremena zadržavanja LV u dišnim putovima važna je za postizanje visokih razina transdukcije u ovom području, ali je do sada bila izazovna.
Kako bismo prevladali ovu prepreku, predlažemo da LV magnetske čestice (MP) mogu pomoći na dva komplementarna načina.Prvo, mogu se voditi magnetom do površine dišnog puta kako bi se poboljšalo ciljanje i pomoglo česticama nositelja gena da budu u pravom području dišnog puta;i ASL) prelaze u stanični sloj 6. MP se naširoko koriste kao ciljana sredstva za isporuku lijekova kada se vežu na antitijela, lijekove za kemoterapiju ili druge male molekule koje se pričvršćuju na stanične membrane ili se vežu na njihove odgovarajuće stanične površinske receptore i nakupljaju na mjestima tumora u prisutnost statičkog elektriciteta.Magnetska polja za terapiju raka 7. Druge "hipertermijske" metode usmjerene su na ubijanje tumorskih stanica zagrijavanjem MP kada su izloženi oscilirajućim magnetskim poljima.Načelo magnetske transfekcije, u kojem se magnetsko polje koristi kao sredstvo transfekcije za poboljšanje prijenosa DNA u stanice, obično se koristi in vitro korištenjem niza nevirusnih i virusnih genskih vektora za stanične linije koje je teško transducirati ..Utvrđena je učinkovitost LV magnetotransfekcije s isporukom LV MP in vitro u staničnu liniju ljudskog bronhijalnog epitela u prisutnosti statičkog magnetskog polja, povećavajući učinkovitost transdukcije za 186 puta u usporedbi sa samim LV vektorom.LV MT također je primijenjen na in vitro model cistične fibroze, gdje je magnetska transfekcija povećala transdukciju LV u kulturama sučelja zrak-tekućina za faktor 20 u prisutnosti sputuma cistične fibroze10.Međutim, in vivo magnetotransfekcija organa dobila je relativno malo pozornosti i procijenjena je samo u nekoliko studija na životinjama11,12,13,14,15, posebno u plućima16,17.Međutim, mogućnosti magnetske transfekcije u terapiji pluća kod cistične fibroze su jasne.Tan i sur.(2020.) izjavio je da će „validacijska studija o učinkovitoj plućnoj isporuci magnetskih nanočestica otvoriti put za buduće inhalacijske strategije CFTR-a za poboljšanje kliničkih ishoda u bolesnika s cističnom fibrozom”6.
Ponašanje malih magnetskih čestica na površini respiratornog trakta u prisutnosti primijenjenog magnetskog polja teško je vizualizirati i proučavati, pa su stoga slabo shvaćene.U drugim smo studijama razvili metodu X-zraka s faznim kontrastom (PB-PCXI) temeljenu na sinkrotronskom širenju za neinvazivno snimanje i kvantifikaciju sitnih in vivo promjena u dubini ASL18 i ponašanju MCT19,20 za izravno mjerenje hidratacije površine plinskih kanala i koristi se kao rani pokazatelj učinkovitosti liječenja.Osim toga, naša MCT metoda bodovanja koristi čestice promjera 10–35 µm sastavljene od aluminijevog oksida ili stakla s visokim indeksom loma kao MCT markere vidljive s PB-PCXI21.Obje su metode prikladne za oslikavanje niza tipova čestica, uključujući MP.
Zbog visoke prostorne i vremenske rezolucije, naši ASL i MCT testovi temeljeni na PB-PCXI dobro su prikladni za proučavanje dinamike i obrazaca ponašanja pojedinačnih i skupnih čestica in vivo kako bi nam pomogli razumjeti i optimizirati metode dostave MP gena.Pristup koji ovdje koristimo temelji se na našim studijama koje koriste SPring-8 BL20B2 beamline, u kojima smo vizualizirali kretanje tekućine nakon isporuke doze lažnog vektora u nosne i plućne dišne ​​putove miševa kako bismo objasnili naše opažene heterogene obrasce ekspresije gena u našem genu.ispitivanja na životinjama s nosivom dozom od 3,4 .
Cilj ove studije bio je koristiti PB-PCXI sinkrotron za vizualizaciju in vivo pokreta niza MP u dušniku živih štakora.Ove PB-PCXI studije snimanja osmišljene su za testiranje serije MP, jačine magnetskog polja i lokacije kako bi se odredio njihov učinak na kretanje MP.Pretpostavili smo da bi vanjsko magnetsko polje pomoglo isporučenom MF-u da ostane ili se pomakne u ciljno područje.Ove su nam studije također omogućile da odredimo konfiguracije magneta koje maksimalno povećavaju količinu čestica preostalih u dušniku nakon taloženja.U drugoj seriji studija, namjeravali smo upotrijebiti ovu optimalnu konfiguraciju kako bismo demonstrirali uzorak transdukcije koji je rezultat in vivo dostave LV-MP u dišne ​​putove štakora, pod pretpostavkom da bi isporuka LV-MP u kontekstu ciljanja dišnih putova rezultirala u povećanoj učinkovitosti LV transdukcije..
Sve studije na životinjama provedene su u skladu s protokolima koje je odobrilo Sveučilište u Adelaideu (M-2019-060 i M-2020-022) i SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Pokusi su provedeni u skladu s preporukama ARRIVE-a.
Sve rendgenske slike snimljene su na liniji snopa BL20XU na sinkrotronu SPring-8 u Japanu koristeći postavku sličnu prethodno opisanoj21,22.Ukratko, eksperimentalna kutija nalazila se 245 m od skladišnog prstena sinkrotrona.Udaljenost između uzorka i detektora od 0,6 m koristi se za studije slikanja čestica i 0,3 m za studije slikanja in vivo za stvaranje efekata faznog kontrasta.Korišten je monokromatski snop s energijom od 25 keV.Slike su dobivene pomoću rendgenskog pretvarača visoke rezolucije (SPring-8 BM3) spojenog na sCMOS detektor.Pretvornik pretvara X-zrake u vidljivu svjetlost pomoću scintilatora debljine 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), koji se zatim usmjerava na sCMOS senzor pomoću ×10 (NA 0,3) mikroskopskog objektiva.sCMOS detektor bio je Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) s veličinom niza od 2048 × 2048 piksela i sirovom veličinom piksela od 6,5 × 6,5 µm.Ova postavka daje efektivnu izotropnu veličinu piksela od 0,51 µm i vidno polje od približno 1,1 mm × 1,1 mm.Trajanje izloženosti od 100 ms odabrano je kako bi se maksimizirao omjer signala i šuma magnetskih čestica unutar i izvan dišnih putova, dok su artefakti kretanja uzrokovani disanjem svedeni na minimum.Za studije in vivo, brzi rendgenski zatvarač postavljen je na putanju rendgenskih zraka kako bi se ograničila doza zračenja blokiranjem snopa rendgenskih zraka između izlaganja.
LV medij nije korišten ni u jednoj studiji snimanja SPring-8 PB-PCXI jer komora za snimanje BL20XU nije certificirana za razinu 2 biološke sigurnosti.Umjesto toga, odabrali smo niz dobro okarakteriziranih MP-ova od dva komercijalna dobavljača koji pokrivaju niz veličina, materijala, koncentracija željeza i primjena, — prvo kako bismo razumjeli kako magnetska polja utječu na kretanje MP-ova u staklenim kapilarama, a zatim u živi dišni putevi.površinski.Veličina MP varira od 0,25 do 18 µm i izrađena je od različitih materijala (vidi tablicu 1), ali je sastav svakog uzorka, uključujući veličinu magnetskih čestica u MP, nepoznat.Na temelju naših opsežnih studija MCT-a 19, 20, 21, 23, 24, očekujemo da se MP-ovi do 5 µm mogu vidjeti na površini trahealnog dišnog puta, na primjer, oduzimanjem uzastopnih okvira kako bi se vidjela poboljšana vidljivost MP-pokreta.Jedan MP od 0,25 µm manji je od razlučivosti uređaja za snimanje, ali očekuje se da će PB-PCXI detektirati njihov volumetrijski kontrast i kretanje površinske tekućine na koju su taloženi nakon taloženja.
Uzorci za svaki MP u tablici.1 je pripremljen u staklenim kapilarama od 20 μl (Drummond Microcaps, PA, SAD) s unutarnjim promjerom od 0,63 mm.Korpuskularne čestice dostupne su u vodi, dok su CombiMag čestice dostupne u vlastitoj tekućini proizvođača.Svaka se epruveta do pola napuni tekućinom (približno 11 µl) i stavi na držač uzorka (vidi sliku 1).Staklene kapilare postavljene su vodoravno na postolje u komori za snimanje i postavljene na rubove tekućine.Magnet s ljuskom od nikla promjera 19 mm (28 mm dug) napravljen od rijetke zemlje, neodija, željeza i bora (NdFeB) (N35, kat. br. LM1652, Jaycar Electronics, Australija) s remanencijom od 1,17 T bio je pričvršćen na odvojeni prijenosni stol za postizanje Daljinski promijenite svoj položaj tijekom iscrtavanja.Rendgensko snimanje počinje kada se magnet postavi otprilike 30 mm iznad uzorka, a slike se snimaju brzinom od 4 slike u sekundi.Tijekom snimanja, magnet je bio primaknut staklenoj kapilarnoj cijevi (na udaljenost od oko 1 mm), a zatim se pomicao duž cijevi kako bi se procijenio učinak jakosti polja i položaja.
Postavka za in vitro snimanje koja sadrži MP uzorke u staklenim kapilarama u fazi translacije xy uzorka.Put zraka X-zraka označen je crvenom točkastom linijom.
Nakon što je uspostavljena in vitro vidljivost MP-a, podskup njih testiran je in vivo na divljem tipu ženki Wistar albino štakora (~12 tjedana starosti, ~200 g).Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) i butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Štakori su anestezirani Pharma (Japan) smjesom intraperitonealnom injekcijom.Nakon anestezije, pripremljeni su za snimanje uklanjanjem krzna oko dušnika, umetanjem endotrahealnog tubusa (ET; 16 Ga intravenska kanila, Terumo BCT) i imobilizacijom u ležećem položaju na posebno izrađenoj ploči za snimanje koja sadrži termo vrećicu za održavanje tjelesne temperature.22. Ploča za snimanje je zatim pričvršćena na postolje uzorka u kutiji za snimanje pod blagim kutom kako bi se traheja vodoravno poravnala na rendgenskoj slici kao što je prikazano na slici 2a.
(a) Postavka snimanja in vivo u jedinici za snimanje SPring-8, putanja rendgenske zrake označena crvenom točkastom linijom.(b,c) Trahealna magnetna lokalizacija izvedena je daljinski pomoću dvije ortogonalno postavljene IP kamere.Na lijevoj strani slike na ekranu možete vidjeti žičanu omču koja drži glavu i kanilu za isporuku instaliranu unutar ET cijevi.
Sustav pumpe štrcaljke s daljinskim upravljanjem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) pomoću staklene štrcaljke od 100 µl spojen je na PE10 cijev (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) pomoću igle od 30 Ga.Označite tubus kako biste bili sigurni da je vrh u ispravnom položaju u dušniku prilikom umetanja endotrahealnog tubusa.Korištenjem mikropumpe, klip štrcaljke je uklonjen i vrh epruvete je uronjen u MP uzorak koji se isporučuje.Napunjena cijev za isporuku je zatim umetnuta u endotrahealni tubus, postavljajući vrh na najjači dio našeg očekivanog primijenjenog magnetskog polja.Snimanje slike kontrolirano je pomoću detektora daha povezanog s našom vremenskom kutijom temeljenom na Arduinu, a svi signali (npr. temperatura, disanje, otvaranje/zatvaranje zatvarača i stjecanje slike) snimljeni su pomoću Powerlaba i LabCharta (AD Instruments, Sydney, Australija) 22 Prilikom snimanja Kada kućište nije bilo dostupno, dvije IP kamere (Panasonic BB-SC382) bile su postavljene pod kutom od približno 90° jedna u odnosu na drugu i korištene za kontrolu položaja magneta u odnosu na dušnik tijekom snimanja (Slika 2b, c).Kako bi se artefakti kretanja sveli na najmanju moguću mjeru, jedna slika po udisaju snimljena je tijekom završnog platoa respiratornog protoka.
Magnet je pričvršćen na drugi stupanj, koji se može nalaziti udaljeno s vanjske strane tijela za snimanje.Ispitani su različiti položaji i konfiguracije magneta, uključujući: postavljen pod kutom od približno 30° iznad dušnika (konfiguracije su prikazane na slikama 2a i 3a);jedan magnet iznad životinje, a drugi ispod, s polovima postavljenim za privlačenje (slika 3b)., jedan magnet iznad životinje i jedan ispod, s polovima postavljenim za odbijanje (Slika 3c), i jedan magnet iznad i okomito na traheju (Slika 3d).Nakon postavljanja životinje i magneta i stavljanja MP koji se testira u pumpu štrcaljke, isporučite dozu od 50 µl brzinom od 4 µl/s nakon snimanja slika.Magnet se zatim pomiče naprijed-natrag uzduž ili poprijeko traheje dok nastavlja sa snimanjem slika.
Konfiguracija magneta za in vivo snimanje (a) jedan magnet iznad traheje pod kutom od približno 30°, (b) dva magneta konfigurirana za privlačenje, (c) dva magneta konfigurirana za odbijanje, (d) jedan magnet iznad i okomito na dušnik.Promatrač je pogledao dolje od usta do pluća kroz dušnik i zraka X-zraka prošla je kroz lijevu stranu štakora i izašla na desnu stranu.Magnet se pomiče po dužini dišnog puta ili lijevo i desno iznad dušnika u smjeru rendgenske zrake.
Također smo nastojali odrediti vidljivost i ponašanje čestica u dišnim putevima u odsutnosti miješanja disanja i otkucaja srca.Stoga su na kraju razdoblja snimanja životinje humano eutanazirane zbog predoziranja pentobarbitalom (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, SAD; ~65 mg/kg ip).Neke su životinje ostavljene na platformi za snimanje, a nakon prestanka disanja i otkucaja srca proces snimanja je ponovljen, uz dodavanje dodatne doze MP-a ako MP nije bio vidljiv na površini dišnog puta.
Rezultirajuće slike ispravljene su za ravno i tamno polje, a zatim sastavljene u film (20 sličica u sekundi; 15-25 × normalna brzina, ovisno o stopi disanja) pomoću prilagođene skripte napisane u MATLAB-u (R2020a, The Mathworks).
Sve studije o isporuci vektora gena LV provedene su u Centru za laboratorijska istraživanja životinja Sveučilišta u Adelaideu i imale su za cilj korištenje rezultata eksperimenta SPring-8 za procjenu može li isporuka LV-MP u prisutnosti magnetskog polja poboljšati prijenos gena in vivo .Za procjenu učinaka MF i magnetskog polja tretirane su dvije skupine životinja: jednoj skupini je ubrizgan LV MF s postavljanjem magneta, a drugoj skupini je ubrizgan LV MF bez magneta.
Vektori LV gena generirani su korištenjem prethodno opisanih metoda 25, 26.Vektor LacZ eksprimira gen beta-galaktozidaze lokaliziran u jezgri kojeg pokreće MPSV konstitutivni promotor (LV-LacZ), koji proizvodi plavi produkt reakcije u transduciranim stanicama, vidljiv na frontama i dijelovima plućnog tkiva.Titracija je provedena u kulturama stanica ručnim brojanjem broja LacZ-pozitivnih stanica pomoću hemocitometra za izračunavanje titra u TU/ml.Nosači se kriokonzerviraju na -80°C, odmrzavaju prije upotrebe i vežu za CombiMag miješanjem 1:1 i inkubiranjem na ledu najmanje 30 minuta prije isporuke.
Normalni štakori Sprague Dawley (n = 3/skupini, ~2-3 anestezirana ip sa mješavinom 0,4 mg/kg medetomidina (Domitor, Ilium, Australija) i 60 mg/kg ketamina (Ilium, Australija) u dobi od 1 mjeseca) ip ) injekcija i nekirurška oralna kanila s 16 Ga intravenskom kanilom.Kako bi se osiguralo da tkivo trahealnog dišnog puta dobije LV transdukciju, kondicionirano je pomoću našeg prethodno opisanog protokola mehaničke perturbacije u kojem je površina trahealnog dišnog puta trljana aksijalno žičanom košaricom (N-krug, ekstraktor nitinol kamenca bez vrha NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, SAD) 30 str.28.Zatim, oko 10 minuta nakon perturbacije u biosigurnosnom kabinetu, izvršena je trahealna primjena LV-MP.
Magnetsko polje korišteno u ovom eksperimentu konfigurirano je slično in vivo rendgenskoj studiji, s istim magnetima koji su držani iznad dušnika sa stezaljkama za destilacijski stent (Slika 4).Volumen od 50 µl (alikvoti od 2 x 25 µl) LV-MP isporučen je u dušnik (n = 3 životinje) pomoću pipete s vrhom gela kao što je prethodno opisano.Kontrolna skupina (n = 3 životinje) primila je isti LV-MP bez uporabe magneta.Nakon završetka infuzije, kanila se uklanja iz endotrahealnog tubusa i životinja se ekstubira.Magnet ostaje na mjestu 10 minuta prije uklanjanja.Štakorima je supkutano doziran meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Australija) nakon čega je uslijedilo povlačenje anestezije intraperitonealnom injekcijom 1 mg/kg atipamazol hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Australija).Štakori su držani na toplom i promatrani do potpunog oporavka od anestezije.
Uređaj za isporuku LV-MP u biološko sigurnom kabinetu.Možete vidjeti da svijetlosivi Luer-lock rukavac ET cijevi strši iz usta, a vrh pipete za gel prikazan na slici umetnut je kroz ET cijev do željene dubine u dušnik.
Tjedan dana nakon postupka primjene LV-MP, životinje su humano žrtvovane inhalacijom 100% CO2, a ekspresija LacZ-a procijenjena je pomoću našeg standardnog X-gal tretmana.Tri najkaudalnija prstena hrskavice uklonjena su kako bi se osiguralo da bilo kakva mehanička oštećenja ili zadržavanje tekućine zbog postavljanja endotrahealne cijevi neće biti uključeni u analizu.Svaka je traheja prerezana po dužini kako bi se dobile dvije polovice za analizu i stavljena u čašicu koja sadrži silikonsku gumu (Sylgard, Dow Inc) pomoću igle Minutien (Fine Science Tools) za vizualizaciju luminalne površine.Raspodjela i karakter transduciranih stanica potvrđeni su frontalnom fotografijom pomoću mikroskopa Nikon (SMZ1500) s kamerom DigiLite i softverom TCapture (Tucsen Photonics, Kina).Slike su snimljene s povećanjem od 20x (uključujući maksimalnu postavku za punu širinu dušnika), s cijelom duljinom dušnika prikazanom korak po korak, osiguravajući dovoljno preklapanja između svake slike kako bi se slike mogle "spojiti".Slike iz svakog dušnika zatim su kombinirane u jednu kompozitnu sliku pomoću Composite Image Editora verzije 2.0.3 (Microsoft Research) koristeći planarni algoritam kretanja. Područje ekspresije LacZ unutar trahealnih kompozitnih slika svake životinje kvantificirano je pomoću automatizirane MATLAB skripte (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano28, koristeći postavke 0,35 < nijansa < 0,58, zasićenost > 0,15 i vrijednost < 0,7. Područje ekspresije LacZ unutar trahealnih kompozitnih slika svake životinje kvantificirano je pomoću automatizirane MATLAB skripte (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano28, koristeći postavke 0,35 < Nijansa < 0,58, Zasićenost > 0,15 i Vrijednost < 0,7. Prikažite LacZ ekspresije u sastavnim slikama traheija svakog životinjskog svijeta u određenoj je mjeri određeno korištenjem automatiziranog scenarija MATLAB (R2020a, MathWorks), kako je ranije opisano28, uz postavke korištenja 0,35 <ottenok <0,58, nasićenost> 0,15 i <0 ,7. Područje ekspresije LacZ-a u kompozitnim trahejalnim slikama svake životinje kvantificirano je pomoću automatizirane MATLAB skripte (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano28 koristeći postavke od 0,350,15 i vrijednost<0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。 ..................................................... HIP Područja ekspresije LacZ na sastavnim slikama traheja svakog životinjskog kvantiteta određena su pomoću automatiziranog scenarija MATLAB (R2020a, MathWorks), kao što je ranije opisano, uz korištenje postavki 0,35 <ottenok <0,58, nasićenost> 0,15 i vrijednost <0,7 . Područja ekspresije LacZ na kompozitnim slikama dušnika svake životinje kvantificirana su pomoću automatizirane MATLAB skripte (R2020a, MathWorks) kao što je prethodno opisano korištenjem postavki od 0,35 < nijansa < 0,58, zasićenost > 0,15 i vrijednost < 0,7.Praćenjem kontura tkiva u GIMP v2.10.24, ručno je stvorena maska ​​za svaku kompozitnu sliku kako bi se identificiralo područje tkiva i spriječilo bilo kakvo lažno otkrivanje izvan trahealnog tkiva.Obojene površine sa svih kompozitnih slika svake životinje su zbrojene kako bi se dobila ukupna obojena površina za tu životinju.Obojeno područje je zatim podijeljeno s ukupnom površinom maske kako bi se dobilo normalizirano područje.
Svaka traheja je umetnuta u parafin i izrezana debljine 5 µm.Sekcije su obojene neutralnom brzom crvenom bojom 5 minuta, a slike su dobivene pomoću mikroskopa Nikon Eclipse E400, DS-Fi3 kamere i NIS softvera za snimanje elemenata (verzija 5.20.00).
Sve statističke analize provedene su u GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistička značajnost postavljena je na p ≤ 0,05.Normalnost je testirana pomoću Shapiro-Wilkovog testa, a razlike u bojanju LacZ procijenjene su pomoću neuparenog t-testa.
Šest MP-a opisanih u tablici 1 pregledao je PCXI, a vidljivost je opisana u tablici 2. Dva polistirenska MP-a (MP1 i MP2; 18 µm odnosno 0,25 µm) nisu bila vidljiva pomoću PCXI-a, ali preostali uzorci mogli su se identificirati (primjeri su prikazani na slici 5).MP3 i MP4 su slabo vidljivi (10-15% Fe3O4; 0,25 µm odnosno 0,9 µm).Iako je MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) sadržavao neke od najmanjih ispitanih čestica, bio je najizraženiji.Proizvod CombiMag MP6 teško je razlikovati.U svim slučajevima, naša sposobnost otkrivanja MF-a bila je znatno poboljšana pomicanjem magneta naprijed-natrag paralelno s kapilarom.Kako su se magneti odmicali od kapilare, čestice su se izvlačile u dugim lancima, ali kako su se magneti približavali i kako se jačina magnetskog polja povećavala, lanci čestica su se skraćivali kako su čestice migrirale prema gornjoj površini kapilare (pogledajte Dodatni video S1 : MP4), povećavajući gustoću čestica na površini.Obrnuto, kada se magnet ukloni iz kapilare, jakost polja se smanjuje, a MP-ovi se preuređuju u dugačke lance koji se protežu od gornje površine kapilare (vidi Dodatni video S2: MP4).Nakon što se magnet prestane kretati, čestice se nastavljaju kretati još neko vrijeme nakon postizanja ravnotežnog položaja.Kako se MP kreće prema i od gornje površine kapilare, magnetske čestice nastoje povući krhotine kroz tekućinu.
Vidljivost MP-a pod PCXI-om znatno varira između uzoraka.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Sve ovdje prikazane slike snimljene su magnetom postavljenim približno 10 mm izravno iznad kapilare.Očigledni veliki krugovi su mjehurići zraka zarobljeni u kapilarama, jasno pokazujući crne i bijele rubne karakteristike fazno kontrastne slike.Crveni okvir označava povećanje koje povećava kontrast.Imajte na umu da promjeri magnetskih krugova na svim slikama nisu u mjerilu i približno su 100 puta veći od prikazanog.
Kako se magnet pomiče lijevo-desno duž vrha kapilare, kut MP žice se mijenja kako bi se poravnao s magnetom (vidi sliku 6), ocrtavajući tako linije magnetskog polja.Za MP3-5, nakon što struna dosegne kut praga, čestice se povlače duž gornje površine kapilare.To često rezultira grupiranjem MP-ova u veće skupine blizu mjesta gdje je magnetsko polje najjače (pogledajte Dodatni video S3: MP5).To je također posebno vidljivo pri snimanju blizu kraja kapilare, što uzrokuje agregaciju i koncentraciju MP-a na granici tekućina-zrak.Čestice u MP6, koje je bilo teže razlikovati od onih u MP3-5, nisu se vukle kada se magnet kretao duž kapilare, ali su se žice MP odvojile, ostavljajući čestice u vidokrugu (vidi Dodatni video S4: MP6).U nekim slučajevima, kada je primijenjeno magnetsko polje smanjeno pomicanjem magneta na veliku udaljenost od mjesta snimanja, svi preostali MP-ovi su se gravitacijom polako spustili na donju površinu cijevi, ostajući u nizu (pogledajte Dodatni video S5: MP3) .
Kut MP žice se mijenja kako se magnet pomiče udesno iznad kapilare.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Crveni okvir označava povećanje koje povećava kontrast.Imajte na umu da su dodatni videozapisi u informativne svrhe jer otkrivaju važnu strukturu čestica i dinamičke informacije koje se ne mogu vizualizirati na ovim statičnim slikama.
Naši testovi su pokazali da polagano pomicanje magneta naprijed-natrag duž traheje olakšava vizualizaciju MF-a u kontekstu složenog kretanja in vivo.Nisu provedena ispitivanja in vivo jer zrnca polistirena (MP1 i MP2) nisu bila vidljiva u kapilari.Svaki od preostala četiri MF testiran je in vivo s dugom osi magneta postavljenom iznad dušnika pod kutom od oko 30° u odnosu na vertikalu (vidi slike 2b i 3a), jer je to rezultiralo dužim MF lancima i bilo je učinkovitije nego magnet..konfiguracija prekinuta.MP3, MP4 i MP6 nisu pronađeni u dušniku nijedne žive životinje.Prilikom vizualizacije dišnog trakta štakora nakon humanog usmrćivanja životinja, čestice su ostale nevidljive čak i kada je dodat dodatni volumen pomoću pumpe za štrcaljku.MP5 je imao najveći sadržaj željeznog oksida i bio je jedina vidljiva čestica, pa je korišten za procjenu i karakterizaciju ponašanja MP in vivo.
Postavljanje magneta preko dušnika tijekom umetanja MF rezultiralo je koncentriranjem mnogih, ali ne svih, MF u vidnom polju.Ulazak čestica u dušnik najbolje se opaža kod humano eutanaziranih životinja.Slika 7 i dodatni video S6: MP5 prikazuje brzo magnetsko hvatanje i poravnavanje čestica na površini ventralne traheje, što ukazuje da se MP-ovi mogu ciljati na željena područja traheje.Prilikom pretraživanja distalnije duž dušnika nakon isporuke MF-a, neki MF-i su pronađeni bliže karini, što ukazuje na nedovoljnu jakost magnetskog polja za prikupljanje i zadržavanje svih MF-ova, budući da su isporučeni kroz područje maksimalne jakosti magnetskog polja tijekom primjene tekućine.postupak.Međutim, postnatalne koncentracije MP bile su veće oko područja slike, što sugerira da su mnogi MP ostali u regijama dišnih putova gdje je primijenjena jakost magnetskog polja bila najveća.
Slike (a) prije i (b) nakon isporuke MP5 u dušnik nedavno eutanaziranog štakora s magnetom postavljenim točno iznad područja snimanja.Prikazano područje nalazi se između dva hrskavična prstena.Ima nešto tekućine u dišnim putevima prije isporuke MP-a.Crveni okvir označava povećanje koje povećava kontrast.Ove su slike preuzete iz videa prikazanog u S6: MP5 dodatni video.
Pomicanje magneta duž dušnika in vivo rezultiralo je promjenom kuta MP lanca na površini dišnih putova, slično onom uočenom u kapilarama (vidi sliku 8 i dodatni video S7: MP5).Međutim, u našoj studiji, MP-ovi se nisu mogli vući po površini živih dišnih puteva, kao što su to činile kapilare.U nekim slučajevima, MP lanac se produljuje kako se magnet pomiče lijevo-desno.Zanimljivo je da smo također otkrili da lanac čestica mijenja dubinu površinskog sloja tekućine kada se magnet pomiče uzdužno duž traheje i širi se kada se magnet pomiče izravno iznad glave i lanac čestica se rotira u okomiti položaj (vidi Dodatni video S7).: MP5 na 0:09, dolje desno).Karakterističan uzorak kretanja promijenio se kada je magnet pomaknut bočno preko vrha dušnika (tj. lijevo ili desno od životinje, umjesto duž duljine dušnika).Čestice su još uvijek bile jasno vidljive tijekom njihovog kretanja, ali kada je magnet uklonjen iz dušnika, vrhovi nizova čestica postali su vidljivi (pogledajte Dodatni video S8: MP5, počevši od 0:08).To se slaže s promatranim ponašanjem magnetskog polja pod djelovanjem primijenjenog magnetskog polja u staklenoj kapilari.
Uzorci slika koji prikazuju MP5 u dušniku živog anesteziranog štakora.(a) Magnet se koristi za dobivanje slika iznad i lijevo od traheje, zatim (b) nakon pomicanja magneta udesno.Crveni okvir označava povećanje koje povećava kontrast.Ove slike su iz videa prikazanog u S7 dodatnom videu: MP5.
Kad su dva pola bila podešena u smjeru sjever-jug iznad i ispod dušnika (tj. privlače; sl. 3b), MP akorde su izgledale duže i bile su smještene na bočnoj stijenci dušnika, a ne na dorzalnoj površini traheje. dušnik (vidi Dodatak).Video S9:MP5).Međutim, visoke koncentracije čestica na jednom mjestu (tj. na dorzalnoj površini dušnika) nisu otkrivene nakon primjene tekućine pomoću uređaja s dva magneta, što se obično događa s uređajem s jednim magnetom.Zatim, kada je jedan magnet bio konfiguriran da odbija suprotne polove (slika 3c), broj čestica vidljivih u vidnom polju nije se povećao nakon isporuke.Postavljanje obje dvije konfiguracije magneta je izazovno zbog velike jakosti magnetskog polja koje privlači ili gura magnete.Postavka je zatim promijenjena na jedan magnet paralelan s dišnim putovima, ali koji prolazi kroz dišne ​​putove pod kutom od 90 stupnjeva tako da linije sile prelaze stijenku traheje ortogonalno (Slika 3d), orijentacija koja je trebala odrediti mogućnost agregacije čestica na bočni zid.biti promatran.Međutim, u ovoj konfiguraciji, nije bilo prepoznatljivog MF nakupljanja kretanja ili kretanja magneta.Na temelju svih ovih rezultata odabrana je konfiguracija s jednim magnetom i orijentacijom od 30 stupnjeva za in vivo studije nositelja gena (slika 3a).
Kada je životinja više puta snimljena odmah nakon što je humano žrtvovana, odsutnost ometajućeg gibanja tkiva značila je da su se finije, kraće linije čestica mogle razaznati u jasnom interkartilaginalnom polju, 'njihajući' u skladu s translatornim kretanjem magneta.jasno vidjeti prisutnost i kretanje MP6 čestica.
Titar LV-LacZ bio je 1,8 x 108 IU/mL, a nakon miješanja 1:1 s CombiMag MP (MP6), životinjama je ubrizgano 50 µl trahealne doze od 9 x 107 IU/ml LV nosača (tj. 4,5 x 106 TU/štakor).).).U ovim studijama, umjesto pomicanja magneta tijekom poroda, fiksirali smo magnet u jednom položaju kako bismo utvrdili može li se transdukcija LV (a) poboljšati u usporedbi s vektorskom isporukom u odsutnosti magnetskog polja i (b) može li dišni put biti usredotočen.Stanice koje se transduciraju u magnetskim ciljnim područjima gornjeg dišnog trakta.
Čini se da prisutnost magneta i uporaba CombiMaga u kombinaciji s LV vektorima nije negativno utjecala na zdravlje životinja, kao što je to učinio naš standardni protokol isporuke LV vektora.Frontalne slike trahealne regije podvrgnute mehaničkoj perturbaciji (dopunska slika 1) pokazale su da je grupa tretirana LV-MP-om imala značajno više razine transdukcije u prisutnosti magneta (slika 9a).U kontrolnoj skupini bila je prisutna samo mala količina plavog LacZ bojenja (Slika 9b).Kvantifikacija X-Gal-obojanih normaliziranih regija pokazala je da je primjena LV-MP u prisutnosti magnetskog polja rezultirala približno 6-strukim poboljšanjem (slika 9c).
Primjer kompozitnih slika koje prikazuju trahealnu transdukciju s LV-MP (a) u prisutnosti magnetskog polja i (b) u odsutnosti magneta.(c) Statistički značajno poboljšanje u normaliziranom području LacZ transdukcije u dušniku uz upotrebu magneta (*p = 0,029, t-test, n = 3 po skupini, srednja vrijednost ± standardna pogreška srednje vrijednosti).
Neutralni brzo crveno obojeni dijelovi (primjer prikazan na Dodatnoj slici 2) pokazuju da su stanice obojene LacZ-om prisutne u istom uzorku i na istoj lokaciji kao što je prethodno objavljeno.
Ključni izazov u genskoj terapiji dišnih putova ostaje precizna lokalizacija čestica nosača u područjima od interesa i postizanje visoke razine učinkovitosti transdukcije u pokretnim plućima uz prisutnost protoka zraka i aktivnog čišćenja sluzi.Za nosače LV namijenjene liječenju bolesti dišnog sustava kod cistične fibroze povećanje vremena zadržavanja čestica nosača u provodnim dišnim putovima do sada je bio nedostižan cilj.Kao što su istaknuli Castellani i sur., korištenje magnetskih polja za poboljšanje transdukcije ima prednosti u odnosu na druge metode isporuke gena kao što je elektroporacija jer može kombinirati jednostavnost, ekonomičnost, lokaliziranu dostavu, povećanu učinkovitost i kraće vrijeme inkubacije.i eventualno manju dozu nosača10.Međutim, in vivo taloženje i ponašanje magnetskih čestica u dišnim putovima pod utjecajem vanjskih magnetskih sila nikada nije opisano, a zapravo sposobnost ove metode da poveća razinu ekspresije gena u netaknutim živim dišnim putovima nije dokazana in vivo.
Naši in vitro eksperimenti na PCXI sinkrotronu pokazali su da su sve čestice koje smo testirali, s iznimkom MP polistirena, bile vidljive u postavkama snimanja koje smo koristili.U prisutnosti magnetskog polja, magnetska polja formiraju nizove čija je duljina povezana s vrstom čestica i jakošću magnetskog polja (tj. blizinom i kretanjem magneta).Kao što je prikazano na slici 10, strune koje promatramo formiraju se kako svaka pojedinačna čestica postaje magnetizirana i inducira vlastito lokalno magnetsko polje.Ova odvojena polja uzrokuju skupljanje drugih sličnih čestica i povezivanje s grupnim kretanjem nizova zbog lokalnih sila iz lokalnih sila privlačenja i odbijanja drugih čestica.
Dijagram koji prikazuje (a, b) lance čestica koje se formiraju unutar kapilara ispunjenih tekućinom i (c, d) dušnik ispunjen zrakom.Imajte na umu da kapilare i dušnik nisu nacrtani u mjerilu.Ploča (a) također sadrži opis MF-a koji sadrži čestice Fe3O4 raspoređene u lance.
Kada se magnet pomaknuo preko kapilare, kut niza čestica dosegao je kritični prag za MP3-5 koji sadrži Fe3O4, nakon čega niz čestica više nije ostao u svom izvornom položaju, već se po površini pomaknuo na novi položaj.magnet.Ovaj se učinak vjerojatno događa jer je površina staklene kapilare dovoljno glatka da dopusti ovo kretanje.Zanimljivo je da se MP6 (CombiMag) nije tako ponašao, možda zato što su čestice bile manje, imale drugačiji premaz ili površinski naboj ili je vlasnička tekućina nosač utjecala na njihovu sposobnost kretanja.Kontrast na CombiMag slici čestica također je slabiji, što sugerira da tekućina i čestice mogu imati istu gustoću i stoga se ne mogu lako kretati jedna prema drugoj.Čestice se također mogu zaglaviti ako se magnet kreće prebrzo, što ukazuje na to da jakost magnetskog polja ne može uvijek nadvladati trenje između čestica u tekućini, sugerirajući da jakost magnetskog polja i udaljenost između magneta i ciljnog područja ne bi trebali biti kao iznenađenje.važno.Ovi rezultati također pokazuju da, iako magneti mogu uhvatiti mnoge mikročestice koje teku kroz ciljno područje, malo je vjerojatno da se na magnete može pouzdati da pomiču CombiMag čestice duž površine dušnika.Stoga smo zaključili da bi in vivo studije MF LV trebale koristiti statička magnetska polja za fizičko ciljanje određenih područja stabla dišnih putova.
Jednom kada se čestice isporuče u tijelo, teško ih je identificirati u kontekstu složenog pokretnog tkiva tijela, ali je njihova sposobnost detekcije poboljšana vodoravnim pomicanjem magneta preko dušnika kako bi se "migoljile" MP žice.Dok je snimanje u stvarnom vremenu moguće, lakše je uočiti kretanje čestica nakon što je životinja humano ubijena.Koncentracije MP obično su bile najviše na ovom mjestu kada je magnet postavljen iznad područja snimanja, iako su se neke čestice obično nalazile niže u dušniku.Za razliku od in vitro studija, čestice se ne mogu povući niz dušnik kretanjem magneta.Ovo je otkriće u skladu s načinom na koji sluz koja prekriva površinu dušnika obično obrađuje udahnute čestice, hvatajući ih u sluz i potom ih uklanjajući kroz mehanizam mukocilijarnog čišćenja.
Pretpostavili smo da korištenje magneta iznad i ispod dušnika za privlačenje (slika 3b) može rezultirati ujednačenijim magnetskim poljem, umjesto magnetskog polja koje je visoko koncentrirano u jednoj točki, što potencijalno može rezultirati ujednačenijom raspodjelom čestica..Međutim, naša preliminarna studija nije pronašla jasne dokaze koji bi poduprli ovu hipotezu.Slično tome, postavljanje para magneta na odbijanje (slika 3c) nije rezultiralo taloženjem većeg broja čestica u području slike.Ova dva nalaza pokazuju da postavka s dvostrukim magnetom ne poboljšava značajno lokalnu kontrolu MP usmjeravanja i da je rezultirajuće jake magnetske sile teško podesiti, što ovaj pristup čini manje praktičnim.Slično tome, usmjeravanje magneta iznad i poprijeko dušnika (Slika 3d) također nije povećalo broj čestica preostalih u snimljenom području.Neke od ovih alternativnih konfiguracija možda neće biti uspješne jer rezultiraju smanjenjem jakosti magnetskog polja u zoni taloženja.Stoga se konfiguracija jednog magneta na 30 stupnjeva (slika 3a) smatra najjednostavnijom i najučinkovitijom in vivo metodom ispitivanja.
Studija LV-MP pokazala je da kada su LV vektori kombinirani s CombiMagom i isporučeni nakon što su fizički uznemireni u prisutnosti magnetskog polja, razine transdukcije značajno su se povećale u dušniku u usporedbi s kontrolama.Na temelju studija sinkrotronske slike i LacZ rezultata, čini se da magnetsko polje može zadržati LV u dušniku i smanjiti broj vektorskih čestica koje su odmah prodrle duboko u pluća.Takva poboljšanja ciljanja mogu dovesti do veće učinkovitosti uz smanjenje isporučenih titara, neciljane transdukcije, upalnih i imunoloških nuspojava i troškova prijenosa gena.Važno je da se prema proizvođaču CombiMag može koristiti u kombinaciji s drugim metodama prijenosa gena, uključujući druge virusne vektore (kao što je AAV) i nukleinske kiseline.