Giardia duodenum je parazitski organizam koji uzrokuje giardiasis, crijevnu infekciju osobito čestu u male djece s kliničkim znakovima proljeva.Prethodno smo izvijestili da izvanstanični G. duodenalis pokreće aktivaciju nukleotida koji veže unutarstanični receptor 3 (NLRP3) nalik na oligomerizaciju i regulira upalne odgovore domaćina putem izlučivanja izvanstaničnih vezikula (EV).Međutim, točni molekularni obrasci duodenokoknog EV (GEV) povezanog s patogenom koji je uključen u ovaj proces i uloga NLRP3 inflammasoma u giardiji tek treba razjasniti.
Konstruirani su rekombinantni eukariotski ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alpha-2 i alpha-7.3 giardini u GEV, transficirani u mišje primarne peritonealne makrofage i otkriveni mjerenjem ciljne molekule upale kaspaze-1.Provjerena je razina ekspresije p20..G. duodenalis alpha-2 i alpha-7.3 giardine izvorno su identificirane mjerenjem NLRP3 inflamasoma (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-kaspaza-1 i kaspaza-1 p20), lučenje IL.1β razine, razine oligomerizacije apoptotskog mrljastog proteina (ASC) i imunofluorescentna lokalizacija NLRP3 i ASC.Uloga inflammasoma NLRP3 u patogenosti G. duodenalis zatim je procijenjena uporabom miševa kod kojih je aktivacija NLRP3 bila blokirana (miševi s blokiranim NLRP3) i praćene su patološke promjene u tjelesnoj težini, opterećenju dvanaesnika parazitima i duodenalnom tkivu.Osim toga, istražili smo induciraju li hiardini alfa-2 i alfa-7.3 izlučivanje IL-1β in vivo preko NLRP3 inflammasoma i odredili ulogu ovih molekula u patogenosti G. duodenalis u miševa.
Alpha-2 i alpha-7.3 giardine induciraju aktivaciju inflamasoma NLRP3 in vitro.To je dovelo do aktivacije p20 kaspaze-1, povećanja razine ekspresije proteina NLRP3, pro-IL-1β i pro-kaspaze-1, značajnog povećanja izlučivanja IL-1β, stvaranja ASA mrlja u citoplazmi, i indukcija oligomerizacije ASA.NLRP3 upala Gubitak penisa pogoršava patogenost G. duodenalis u miševa.Miševi liječeni cistama gavažom od miševa blokiranih NLRP3 pokazali su povećani broj trofozoita i ozbiljna oštećenja duodenalnih resica, karakterizirana nekrotičnim kriptama sa skupljenim i razgranatim.In vivo eksperimenti su pokazali da giardine alpha-2 i alpha-7.3 mogu inducirati izlučivanje IL-1β preko NLRP3 inflammasoma, a imunizacija s giardine alpha-2 i alpha-7.3 smanjila je patogenost G. duodenalis u miševa.
Uzeti zajedno, rezultati ove studije sugeriraju da giardia alpha-2 i alpha-7.3 uzrokuju regulaciju upale NLRP3 domaćina i smanjuju infektivnost G. duodenalis u miševa, što su obećavajuće mete za prevenciju giardiasis.
Giardia duodenum je izvanstanični protozojski parazit koji živi u tankom crijevu i uzrokuje 280 milijuna slučajeva giardijaze s proljevom godišnje, osobito među malom djecom u zemljama u razvoju [1].Ljudi se zaraze pijući vodu ili hranu kontaminiranu cistama M. duodenuma, koje zatim ulaze u želudac i izlučuju se želučanim sokovima.Trofozoiti Giardia duodenum pričvršćuju se na duodenalni epitel, uzrokujući mučninu, povraćanje, proljev, bolove u trbuhu i gubitak težine.Osobe s imunodeficijencijom i cističnom fibrozom osjetljive su na infekcije.Do infekcije može doći i oralnim i analnim seksom [2].Lijekovi poput metronidazola, tinidazola i nitazoksanida poželjne su opcije liječenja duodenalnih infekcija [3].Međutim, ti kemoterapijski lijekovi uzrokuju nuspojave kao što su mučnina, karcinogeneza i genotoksičnost [4].Stoga je potrebno razviti učinkovitije strategije za sprječavanje infekcije G. duodenalis.
Upale su klasa citosolnih proteinskih kompleksa koji su dio urođenog imunološkog odgovora, pomažu u obrani od invazije patogena i posreduju u upalnim odgovorima [5].Među tim upalama opsežno je proučavan nukleotidno-vezujući oligomerizacijski (NOD) receptor 3 (NLRP3) nukleotid-binding oligomerizacija (NLRP3) nukleotid-binding-like inflammasome koji je opsežno proučavan jer se može detektirati pomoću različitih molekularnih uzoraka povezanih s patogenom/oštećenjem (PAMP/ DAMP), prepoznaje, aktivira urođeni imunološki sustav.i regulira intestinalnu homeostazu kod mnogih upalnih bolesti [6,7,8].Sastoji se od receptora za prepoznavanje uzoraka (PRR) NLRP3, adaptorskog apoptotskog točkastog proteina (ASC) i efektora prokaspaze-1 ili prokaspaze-11.Inflamasom NLRP3 djeluje kao domaćin protiv invazije patogena, kao što je primijećeno u studijama Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] i Leishmania.[11], ali također je objavljeno da aktivacija inflamasoma NLRP3 ograničava zaštitne imunološke odgovore i pogoršava napredovanje bolesti, na primjer, kod crva [12].Na temelju naših prethodnih otkrića, izvijestili smo da izvanstanični G. duodenalis pokreće intracelularnu aktivaciju upale NLRP3 i modulira upalne odgovore domaćina lučenjem izvanstaničnih vezikula (EV) [13].Međutim, ulogu inflamasoma NLRP3 u infekciji G. duodenalis in vivo tek treba odrediti.
Giardini su izvorno opisani kao strukturne komponente citoskeleta G. duodenalis i igraju važnu ulogu u pokretljivosti trofozoita i pričvršćivanju epitelnih stanica u tankom crijevu.Kako bi se bolje prilagodili okolišu i povećali svoju patogenost, trofozoiti G. duodenalis razvili su jedinstvenu citoskeletnu strukturu koja se sastoji od 8 flagela, 1 srednjeg tijela i 1 ventralnog diska [14].Trofozoiti Giardia duodenum koriste svoj citoskelet da prodru u gornji dio tankog crijeva, posebno u duodenum, i pričvrste se za enterocite.Stalno migriraju i pričvršćuju se na epitelne stanice pomoću staničnog metabolizma.Stoga postoji bliska veza između njihovog citoskeleta i virulencije.Giardine specifične za Giardia duodenum komponente su strukture citoskeleta [15] i dijele se u četiri klase: α-, β-, γ- i δ-giardine.Postoji 21 član obitelji α-giardin, od kojih svi imaju sposobnost vezanja fosfolipida ovisnu o kalciju [16].Oni također povezuju citoskelet sa staničnom membranom.U osoba s proljevom uzrokovanim G. duodenalis, α-giardini su jako izraženi i imunoreaktivni tijekom infekcije [17].Heterologna cjepiva koja se temelje na Giardia alfa-1 štite od giardijaze kod miševa i potencijalni su kandidati za antigene za razvoj cjepiva [18].Alpha-8 giardin, lokaliziran u plazma membrani i flagelama, ali ne i u ventralnom disku, pojačava pokretljivost i brzinu rasta trofozoita u G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin se veže za strukture mikrotubula na flagelama i utječe na vitalnost G. duodenalis [20].Alpha-11 giardine prisutna je u izobilju tijekom cijelog životnog ciklusa, a prekomjerna ekspresija alpha-11 giardine oštećuje samu G. duodenalis [21].Međutim, nije jasno štite li alfa-2 giardine i alfa-7.3 giardine od infekcije G. duodenalis i njihovih temeljnih mehanizama.
U ovoj studiji, rekombinantni eukariotski ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine transficirani su u primarne peritonealne makrofage miša da aktiviraju NLRP3 domaćina.Zatim su pregledani ciljevi inflamasoma.Također smo procijenili ulogu inflamasoma NLRP3 u patogenosti G. duodenalis, istražili izazivaju li alfa-2 i alfa-7,3 giardine aktivaciju inflamasoma NLRP3 in vivo i utvrdili da ove dvije uloge giardina u patogenosti g. G. duodenalis.Naš zajednički cilj bio je razviti obećavajuće ciljeve za prevenciju infekcije G. duodenalis.
Divlji tip (WT) C57BL/6 ženke miševa u dobi od 5 do 8 tjedana kupljene su od Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Kina).Miševi su imali slobodan pristup vodi, dobivali su steriliziranu hranu i držani su u ciklusu svjetlo/tama od 12/12 sati.Prije infekcije, miševi su primali antibiotike ad libitum u vodi za piće s dodatkom ampicilina (1 mg/mL), vankomicina (1 mg/mL) i neomicina (1,4 mg/mL) (svi kupljeni iz Šangaja, Kina, umjetni organizmi) [22 ].].Miševi koji su izgubili sposobnost jesti i piti više od 24 sata i izgubili ≥ 20% tjelesne težine humano su eutanazirani dislokacijom cerviksa.
WB G. duodenalis trofozoiti (American Type Culture Collection, Manassas, SAD) su dopunjeni sa 12,5% fetalnog goveđeg seruma (FBS; Every Green, Zhejiang, Kina) i 0,1% goveđe žuči (Sigma-Aldrich, St. Missouri, SAD). ).SAD) u mikroaerobnim uvjetima.Konfluentni trofozoiti sakupljeni su na ledu i pasirani u omjeru 1:4 za daljnju reprodukciju.
Ciste Giardia duodenum inducirane su kako je prethodno opisano [23], trofozoiti su sakupljeni u logaritamskoj fazi i zatim razrijeđeni s medijem za induciranje inkapsulacije, pH 7,1 (modificirani TYI-S-33) do konačne koncentracije od 1 × 106 trofozoita/mL.koncentracija žuči 0.05% srednje).Trofozoiti su uzgajani u anaerobnim uvjetima na 37°C do logaritamske faze rasta.Promijenite medij u medij za izazivanje cista (pH 7,8; ​​modificirani medij TYI-S-33 s 1% koncentracijom žuči) i kulturi G. duodenalis na 37°C tijekom 48-96 sati, tijekom kojih su formirane ciste promatrane pod mikroskopom.Nakon što je većina trofozoita potaknuta na stvaranje cista, mješavina kulture je sakupljena i resuspendirana u sterilnoj deioniziranoj vodi kako bi se lizirali preostali trofozoiti.Ciste su izbrojane i pohranjene na 4°C za naknadne analize kroz želučanu sondu kod miševa.
Izvanstanični vezikuli Giardije (GEV) obogaćeni su kako je prethodno opisano [13].Trofozoiti u logaritamskoj fazi rasta resuspendirani su u modificiranom mediju TYI-S-33 pripremljenom s FBS-om osiromašenim egzosomima (Biological Industries, Beit-Haemek, Izrael) do konačne koncentracije od 1 × 106 parazita/mL i inkubirani 12 sati.izolirani su iz supernatanta kulture centrifugiranjem na 2000 g 10 min, 10 000 g 45 min i 100 000 g 60 min.Precipitati su otopljeni u fosfatno puferiranoj fiziološkoj otopini (PBS), kvantificirani korištenjem kompleta za analizu BCA proteina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) i pohranjeni na -80°C ili korišteni izravno za daljnje analize.
Primarni mišji peritonealni makrofagi pripremljeni su kako je prethodno opisano [24].Ukratko, miševima (u dobi od 6-8 tjedana) ubrizgano je (intraperitonealno [ip]) 2,5 ml 2,98% Difco tekućeg tioglikolnog medija (BD, Franklin Lakes, NJ, SAD) i hranjena su im 3-4 nepca.Suspenzija makrofaga sakupljena je iz trbušne šupljine miševa nakon eutanazije i centrifugirana 3 puta na 1000 g tijekom 10 minuta.Sakupljene stanice detektirane su protočnom citometrijom korištenjem CD11b markera dok čistoća stanica nije bila >98%, zatim dodane na ploče sa 6 jažica za kulturu stanica (4,5 x 106 stanica/jažici) i inkubirane s 10% FBS (Bioindustry) na 37°C.i 5% CO2.
RNA je ekstrahirana iz 1 × 107 trofozoita u 1 ml TRIzol reagensa (Vazyme, Nanjing, Kina), genomska DNA je ekstrahirana iz ukupne G. duodenalis RNA pomoću MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kina) i sintetizirana je komplementarna DNA (cDNA). koristeći MonScript RTIIII Super Mix (Monad) prema uputama proizvođača.
Informacije o CDS sekvenci za ciljni gen G. duodenalis dobivene su iz NCBI GenBank.Upotrijebite Primer 5.0 za dizajniranje specifičnih početnica za bešavno kloniranje za svaki ciljni gen.Prednja početnica (5′-3′) sastoji se od tri dijela: preklapajuće sekvence s lineariziranim vektorom pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) i početnih kodona ATG i GNN (ako prva baza nije G).To se radi kako bi se poboljšala učinkovitost izraza.Dodatno, najmanje 16 bp kombiniranih baza (GC sadržaj 40–60%/Tm približno 55 °C).Obrnuta početnica (5'-3') sastoji se od dva dijela, preklapajuće sekvence s EcoRV-lineariziranim vektorom pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) i kombinirane baze od najmanje 16 bp.(bez zadnje dvije stanice).baze) kodon kao što je AA ili GA koji omogućuje rekombinantnim plazmidima ekspresiju njihovih obilježenih proteina).Slijedovi početnica navedeni su u Tablici 1, a sintetizirao ih je Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kina).
Ciljevi su amplificirani korištenjem Pfu DNA polimeraze (Tiangen, Peking, Kina) ili Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Kina) korištenjem pripremljene cDNA G. duodenalis kao predloška.Eukariotski ekspresijski vektorski plazmid pcDNA3.1(+) lineariziran je restrikcijskim enzimom EcoRV i defosforiliran korištenjem Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearizirani fragmenti pcDNA3.1(+) i amplificirani fragmenti ciljnog gena pročišćeni su pomoću kompleta za pročišćavanje DNA gelom (Tiangen) i kvantificirani pomoću Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragment pcDNA3.1(+) i svaki fragment ciljnog gena rekombinirani su pomoću MonClone smjese za jednostruko kloniranje (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kina) i potvrđeni sekvenciranjem DNK pomoću Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kina)..
Plazmidi bez endotoksina pcDNA3.1(+)-alpha-2 i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 generirani su korištenjem SanPrep Mini kompleta plazmida bez endotoksina (Sangon Biotech).Koncentracija je održavana iznad 500 ng/µl kako bi se osiguralo da EDTA u puferu za ispiranje ne ometa test transfekcije.Primarni peritonealni makrofagi miša uzgajani su u pločama sa 6 jažica s potpunim medijem RPMI 1640 (Biological Industries) tijekom 12 sati, zatim su stanice isprane 3 puta u toplom PBS-u da se uklone penicilin i streptomicin, a zatim u mediju s punim medijem.Plazmidi bez endotoksina pcDNA3.1(+)-alpha-2 i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) razrijeđeni su u 125 μl Opti-MEM reduciranog serumskog medija (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Zatim je 5 µl Lipofectamine 2000 transfekcijskog reagensa (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) razrijeđeno u 125 µl Opti-MEM medija s niskim sadržajem seruma.Pripremite komplekse liposom-DNA miješanjem razrijeđenog plazmida bez endotoksina s Lipofectamine 2000 i ostavljanjem smjese da stoji na sobnoj temperaturi 5 minuta.Prenesite komplekse odvojeno u stanice u svakoj jažici i polako promiješajte.Nakon 4 sata, medij stanične kulture zamijenjen je s 2 ml potpunog medija RPMI 1640 i kultura je nastavljena 24 sata.Svježi medij stanične kulture dodan je stanicama i inkubiran kroz različite vremenske točke, ovisno o dizajnu testa.
Uzorci proteina iz supernatanta i staničnih lizata pripremljeni su kako je prethodno opisano [25].Parametri membranskog prijenosa za pro-IL-1β, pro-kaspazu-1, kaspazu-1 p20, NLRP3, β-aktin i His-tag bili su 200 mA/90 min.Za interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, SAD), kaspazu-1 (p20) (Adipogen, Švicarska) i NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Švicarska) i 1:5000 koji cilja His tag (Amylet Scientific, Wuhan, Kina) i β-aktin (Proteintech, Wuhan, Kina).
Unakrsno povezivanje s disukcinimid suberatom (DSS) provedeno je kako je prethodno opisano [26].Stanice su isprane 3 puta s hladnim PBS-om i potpuno lizirane iglom veličine 27 u 50 µl ASC reakcijskog pufera (pH 8,0) koji sadrži 25 mM Na2P04, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES i 125 mM NaHCO3.Smjesa je centrifugirana na 5000 g tijekom 3 minute i talog je zašiven s 10 ul DSS (25 mM u DMSO) i 40 ul ASC reakcijskog pufera tijekom 30 minuta na 37°C.Nakon centrifugiranja na 5000 g tijekom 10 minuta, talog je otopljen u otopini od 40 µl ASC reakcijskog pufera i 10 µl 6x pufera za punjenje proteina (TransGen, Peking, Kina), a zatim je otopina ugašena na sobnoj temperaturi 15 minuta. min., Zatim kuhajte 10 minuta.Uzorci proteina zatim su podvrgnuti Western blottingu korištenjem primarnih anti-ASC antitijela (Wanleibio, Shenyang, Kina) u omjeru razrjeđenja od 1:500.
Slijedeći prethodno opisani postupak [13], sakupljeni su supernatanti stanične kulture i određeno je izlučivanje proupalnog citokina IL-1β pomoću mišjeg IL-1 Beta ELISA kompleta (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Pretvorite vrijednosti OD450nm u koncentracije proteina pomoću standardne krivulje IL-1β.
Stanice obložene pokrovnim stakalcima nježno su isprane 3 puta u toplom PBS-u, fiksirane u fiksatoru stanica tkiva (Biosharp, Peking, Kina) 10 minuta na sobnoj temperaturi (RT), u 0,1% Triton X-Permeabilize na 100 (razrijeđeno u PBS-u; Biosharp ) 20 minuta na sobnoj temperaturi i blokirajte u 5% goveđem serumskom albuminu (u PBS) 2 sata na sobnoj temperaturi.Stanice su zatim inkubirane preko noći na 4°C s primarnim antitijelima protiv ASC (razrjeđenje 1:100) odnosno NLRP3 (razrjeđenje 1:100), te Cy3 obilježenim kozjim anti-zečjim IgG(H+L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, SAD) ili FITC-konjugirani kozji anti-mišji IgG (1:400; Earthox) preko noći na 37°C u mraku 1 sat.Jezgre su obojene Hoechstom 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kina) tijekom 5 minuta i promatrane pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Miševi su podijeljeni u četiri skupine (n = 7 u svakoj skupini): (i) PBS-tretirana negativna kontrolna skupina (samo PBS; gavaža 100 µl/mišu PBS praćena dnevnom intraperitonealnom injekcijom 100 µl/mišu PBS 3 sata kasnije)., kontinuirano 7 dana);(ii) negativna kontrolna skupina tretirana inhibitorom MCC950 [27] (100 µl/mišu putem PBS sonde, 3 sata kasnije, 10 mg/kg tjelesne težine [TT] MCC950 [u PBS] je primijenjeno intraperitonealno dnevno, trajanje 7 dana);(iii) skupina infekcije cistom G. duodenalis (1,5 x 106 cista/mišu pomoću sonde, 3 sata kasnije, 100 μl/mišu PBS intraperitonealno primijenjeno dnevno tijekom 7 dana);(iv) G. duodenalis cista kombinirana infekcija skupina liječena inhibitorom MCC950 skupina (1,5 × 106 cista/miš putem sonde, 10 mg/kg tjelesne težine MCC950 intraperitonealno dnevno tijekom 7 dana na 3 sata).Tjelesna težina svakog miša praćena je svakodnevno i svi su miševi eutanazirani 7. dana.Sakupljeni duodenum (dugo 3 cm) izrezan je na male komadiće u 1 ml PBS-a, ciste su uništene preko noći u PBS-u na 4°C, a G. duodenalis trofozoiti.Svježi duodenum (dugo 1 cm) izoliran je za bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E).
Miševi su podijeljeni u dvije skupine: (i) kontrolna skupina MOCK i (ii) skupina inhibitora MCC950.Bilo je pet tretmana u svakoj skupini (n = 7/liječenoj skupini): (i) negativna kontrolna skupina tretirana PBS-om (samo PBS; 100 µl/mišu PBS, intramuskularna (IM) injekcija (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plazmidna negativna kontrolna skupina (100 µg/mišja DNA, putem intramuskularne injekcije) (iii) G. duodenalis cista infekcija pozitivne kontrolne skupine (1,5 x 106 cista/miš, putem sonde) (iv) a skupina tretirana s plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 µg/miš DNA, intramuskularnom injekcijom), i (v) skupina tretirana s plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/miš DNK, nakon 12 sati pasaže, miševi u skupini koja je primala inhibitor MCC950 primali su dnevnu intraperitonealnu injekciju MCC950 (10 mg/kg tjelesne težine) tijekom 7 dana, dok su miševi u skupini koja je primala MOCK primali jednaku količinu PBS tretmana. Uzorci krvi su Uzorci seruma prikupljeni su iz očnih jabučica miševa i ostavljeni preko noći na 4 °C pomoću enzimskog imunoanalize (ELISA) za mjerenje razine IL-1β.
Trideset pet miševa podijeljeno je u pet skupina (n=7/skupini).Skupina 1 bila je negativna kontrolna skupina tretirana PBS-om: miševi su primili 100 μl PBS-a intramuskularno i 3 dana kasnije gavažom.Skupina 2 je pozitivna kontrolna skupina zaražena cistama G. duodenalis: miševima je ubrizgano 100 μl PBS-a, a 3 dana kasnije intragastrično je ubrizgano 1,5 x 106 cista/mišu.Treća skupina – plazmidna imunizacija s pcDNA3.1(+) u kombinaciji s kontrolnom skupinom za infekciju duodenalnom cistom: miševi su primili 100 μg plazmidne DNA pcDNA3.1(+)(im) oralno, 1,5×106 cista/miš 3 nekoliko puta. dana.Skupine 4 i 5 bile su rekombinantni pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plazmid ili pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plazmid u kombinaciji s infekcijom cistom G. duodenalis.Eksperimentalna skupina: miševi su primili 100 µg pcDNA3.1(+)-giardine plazmid DNA (im), zatim 3 dana kasnije, 1,5 × 106 cista/miš je ubrizgano putem sonde.Tjelesna težina svakog miša je praćena nakon uvođenja ciste G. duodenalis kroz cijev.Svježi duodenum je sakupljen za mjerenje opterećenja parazitima i analizu bojenja HE.
Histopatološke promjene analizirane su prema prethodno objavljenom postupku [30].Svježi duodenum je fiksiran fiksativom za tkivne stanice, uklopljen u parafin, izrezan na dijelove od 4 μm, obojen H&E i analiziran pod svjetlosnim mikroskopom.Reprezentativne patološke promjene u sedam dijelova tkiva sedam neovisnih miševa procijenio je patolog koji nije bio svjestan liječenja i snimljene su pri povećanju od 200x.Duljina resica i dubina kripti izmjerene su u skladu s prethodno opisanim metodama.
Rezultati in vitro i in vivo dobiveni su u tri primjerka.Grafikoni su generirani korištenjem GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SAD).Razlike između dviju skupina analizirane su t-testom, dok su razlike između ≥3 skupina analizirane jednosmjernom analizom varijance (ANOVA) pomoću softvera SPSS (verzija 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, SAD).Podaci su analizirani na homogenost varijance korištenjem Leveneovog testa praćenog Bonferronijevim post hoc testom (B).Značajnost se izražava kao P<0,05, P<0,01 i P<0,001 (nije značajno [ns]) (P>0,05).
Naša prethodna analiza GEV proteomike u Kyoto enciklopediji gena i genoma (KEGG) pokazala je da mnoge mete mogu biti uključene u aktivaciju upalnih signalnih putova [13].Odabrali smo dvije obećavajuće mete, alfa-2 i alfa-7.3 giardine, umnožiti ove molekule i koristiti ih za konstrukciju pcDNA3.1(+) eukariotskog ekspresijskog vektora.Nakon sekvenciranja, rekombinantni ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alpha-2 i alpha-7.3 giardine transficirani su u primarne mišje peritonealne makrofage, te je identificiran kaspaza-1 p20 proteinski potpis upale (fragment aktivirane kaspaze-1). kao razjašnjavanje ključnih molekula koje mogu potaknuti upalu.Rezultati su pokazali da alfa-2 i alfa-7.3 giardini mogu inducirati ekspresiju p20 kaspaze-1 slično kao GEV.Nije pronađen učinak na aktivaciju kaspaze-1 u netretiranoj negativnoj kontroli (samo PBS) i plazmidnoj kontroli pcDNA3.1(+) (Slika 1).
Mjerenje aktivacije p20 kaspaze-1 pomoću pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardina.Rekombinantni eukariotski ekspresijski plazmidi pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardini (iznad svake trake) transficirani su u primarne mišje peritonealne makrofage, a supernatanti kulture sakupljeni su 24 sata kasnije.Western blot je korišten za mjerenje razine ekspresije signature kaspaze-1 p20 inflamasomskog proteina.Skupina koja je primala samo PBS (traka C) i grupa koja je primala monoterapiju pcDNA3.1(+) (staza pcDNA3.1) korištene su kao negativna kontrola, a skupina za liječenje GEV korištena je kao pozitivna kontrola.Ekspresija rekombinantnog proteina potvrđena je detekcijom histidinske oznake u svakom proteinu, a očekivane proteinske trake bile su alfa-2 giardin (38,2 kDa) i alfa-7,3 giardin (37,2 kDa).GEV, ekstracelularni mjehurići Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearizirani vektor, SUP, supernatant
Da bi se utvrdilo induciraju li alfa-2 giardin i alfa-7.3 giardin ekspresiju p20 kaspaze-1 i igraju li ulogu u aktiviranju upalnog odgovora NLRP3 domaćina, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine i pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin je transfektiran u primarne mišje peritonealne makrofage s rekombinantnom plazmidnom DNA, te su određene razine ekspresije, lokalizacije i oligomerizacije ključnih upalnih proteina NLRP3.U ovom eksperimentu GEV je korišten kao pozitivna kontrolna skupina, a skupina koja nije tretirana (samo PBS) ili skupina koja je primala transfekciju pcDNA3.1(+) bila je negativna skupina.Rezultati su pokazali da je, kao i u GEV skupini, rekombinantna plazmidna DNA giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 i giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 rezultirala regulacijom NLRP3, pro-IL-1β i aktivacija prokaspaze-1 i kaspaze-1 (slika 2a).Uz to, obje giardine inducirale su značajno lučenje IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Slika 2b).Većina ASC proteina bila je monomerna u skupini koja nije tretirana ili u skupini koja je primala transfekciju s pcDNA3.1(+) plazmidom, za razliku od pcDNA3.1(+)-alpha-2 ili pcDNA3.1(+)-alpha- 7,3 giardine.Došlo je do oligomerizacije ASC u rekombinantnoj plazmidnoj DNA GEV pozitivne kontrolne skupine ili skupine, pokazujući oligomerni oblik (Slika 2c).Ovi preliminarni podaci sugeriraju da alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin mogu inducirati aktivaciju upale NLRP3.Naknadna imunofluorescentna istraživanja lokalizacije ASC i NLRP3 pokazala su da je u skupini negativne kontrole protein ASC bio raspršen po citoplazmi i pojavio se kao točkasti signal nakon stimulacije pcDNA3.1(+)-alpha-2 s giardinom ili pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 giardine skupina ili GEV pozitivna kontrolna skupina (Slika 2d).U negativnoj kontroli i skupini tretiranoj s plazmidom pcDNA 3.1, proteinski signal NLRP3 nije otkriven, dok je fluorescentni signal točkast kao odgovor na pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ili pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 je otkriveno..giardine se nalaze u citoplazmi ili nakon stimulacije HEV (Sl. 2e).Ovi podaci nadalje pokazuju da G. duodenalis giardin alpha-2 i giardin alpha-7.3 aktiviraju inflamasom NLRP3 u mišjim primarnim peritonealnim makrofagima.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin aktiviraju inflammasom NLRP3 u mišjim peritonealnim makrofagima.Transficirajte rekombinantne eukariotske ekspresijske plazmide pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin i pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin u primarne mišje peritonealne makrofage i stanice ili sakupite supernatant unutar 24 sata za analizu ekspresije, oligomerizaciju , lučenje.i lokalizacija ključnih upalnih proteina.Skupina koja je primala samo PBS (C) i skupina koja je primala pcDNA3.1(+) pojedinačno korištene su kao negativna kontrola, a skupina koja je primala GEV korištena je kao pozitivna skupina.a Ključni upalni proteini NLRP3, uključujući NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspazu-1 i p20 kaspazu-1, otkriveni su Western blotingom.b Razine izlučivanja IL-1β u supernatantima određene su pomoću enzimski vezanog imunološkog testa (ELISA).Razlike između kontrolne i pokusne skupine analizirane su jednosmjernom analizom varijance (ANOVA) pomoću softvera SPSS verzija 22.0.Zvjezdice označavaju značajne razlike između skupina **P<0,01 i ***P<0,001.c Razine oligomerizacije ASC u peletama određene su DSS analizom unakrsnog povezivanja, dok su razine ASC u lizatima stanica korištene kao kontrola punjenja.d Vizualizacija lokalizacije ISC pomoću imunofluorescencije.e Imunofluorescencija je korištena za vizualizaciju lokalizacije NLRP3.ASC, apoptotski protein sličan mrljama;IL, interleukin;NLRP3, receptor 3 sličan oligomerizaciji za vezanje nukleotida;ns, nije značajno (P > 0,05)
I G. duodenalis i GEVs koje izlučuje aktiviraju inflamasom NLRP3 i reguliraju upalne odgovore domaćina in vitro.Dakle, uloga NLRP3 inflammasoma u patogenosti G. duodenalis ostaje nejasna.Kako bismo istražili ovaj problem, osmislili smo eksperiment između miševa zaraženih cistom G. duodenalis i miševa zaraženih cistom G. duodenalis + liječenje inhibitorom MCC950 i usporedili ekspresiju inflamasoma NLRP3 kada su zaraženi cistom G. duodenalis.Detaljna shema eksperimenta prikazana je na slici 3a.Promjene u tjelesnoj težini miševa u različitim tretiranim skupinama praćene su 7 dana nakon infekcije cistama, a rezultati su prikazani na slici 3b.U usporedbi sa skupinom liječenom čistim PBS-om, rezultati su pokazali da (i) se tjelesna težina miševa zaraženih G. duodenalis cistom smanjila od 3. do 7. dana nakon infekcije;(ii) tretman s inhibitorom MCC950 nije imao značajan učinak na tjelesnu težinu miševa..U usporedbi sa skupinom s jednom infekcijom, BW skupine s duodenalnom infekcijom liječene s MCC950 smanjila se u različitim stupnjevima (1. dan: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2. dan: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; 3. dan: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; 4. dan: ANOVA, F (3, 24) = 1,683, P = 0,0052; 5. dan: ANOVA, F (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; 6. dan: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175; 7. dan: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Ovi podaci pokazuju da inflamasom NLRP3 štiti miševe od značajnog gubitka težine u ranim fazama (2-4 dana) duodenalne infekcije.Zatim smo željeli otkriti trofozoite G. duodenalis u tekućini za ispiranje dvanaesnika, a rezultati su prikazani na slici 3c.U usporedbi sa skupinom s infekcijom cistom G. duodenalis, broj trofozoita u dvanaesniku značajno se povećao nakon blokiranja inflamasoma NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Duodenalno tkivo obojeno HE pokazalo je, u usporedbi s negativnom kontrolom tretiranom samo PBS-om i MCC950: ​​(i) infekcija cistom G. duodenalis rezultirala je oštećenjem duodenalnih resica (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) i atrofija kripte (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) dvanaesnik miševa zaraženih cistama G. duodenalis i tretiranih inhibitorima MCC950.duodenalne resice bile su oštećene i mrtve (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) s atrofijom i grananjem kripte (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Slika 3d- f) .Ovi rezultati sugeriraju da inflamasom NLRP3 igra ulogu u smanjenju patogenosti G. duodenalis.
Uloga inflamasoma NLRP3 u infekciji Giardia duodenum.Miševima je davana sonda (iv) duodenokoknim cistama i zatim tretirana s ili bez MCC950 (ip).Pojedinačne skupine za liječenje s PBS-om ili MCC950 korištene su kao kontrole.Eksperimentalna skupina i režim liječenja.b Tjelesna težina miševa u svakoj od različitih tretiranih skupina praćena je 7 dana.Razlika između skupine zaražene G. duodenalis i skupine za liječenje infekcije G. duodenalis + MCC950 analizirana je t-testom pomoću SPSS softvera verzije 22.0.Zvjezdice označavaju značajne razlike kod *P<0,05, **P<0,01 ili ***P<0,001.c Opterećenje parazitima određeno je brojanjem trofozoita u tekućini za ispiranje dvanaesnika.Razlika između skupine zaražene G. duodenalis i skupine za liječenje infekcije G. duodenalis + MCC950 analizirana je t-testom pomoću SPSS softvera verzije 22.0.Zvjezdice označavaju značajne razlike pri *P < 0,05.d Rezultati bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E) duodenalne histopatologije.Crvene strelice označavaju oštećenje resica, zelene strelice označavaju oštećenje kripti.Mjerna traka: 100 µm.e, f Statistička analiza visine duodenalnih resica i visine kripte miša.Zvjezdice označavaju značajne razlike kod *P<0,05 i **P<0,01.Rezultati su uzeti iz 7 neovisnih bioloških eksperimenata.BW, tjelesna težina;ig, intragastrični put isporuke;ip, intraperitonealni put isporuke;ns, nije značajno (P > 0,05);PBS, fiziološka otopina puferirana fosfatom;WT, divlji tip
Izlučivanje IL-1β je znak aktivacije upale.Kako bismo odredili aktiviraju li G. duodenalis alpha-2 giardine i alpha-7.3 giardine NLRP3 inflamasom domaćina in vivo, koristili smo netretirane WT miševe (lažna skupina) i miševe s blokiranim NLRP3 inflammasomom (liječena skupina s inhibicijom MCC950).Detaljna shema eksperimenta prikazana je na slici 4a.Eksperimentalne skupine sastojale su se od miševa tretiranih PBS-om, tretmanom ciste G. duodenalis gavažom, intramuskularnom injekcijom pcDNA3.1 i intramuskularnom injekcijom pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ili pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Sedmog dana nakon intramuskularne primjene rekombinantnog plazmida, sakupljen je serum i određena je razina IL-1β u svakoj skupini.Kao što je prikazano na slici 4b, u skupini MOCK: (i) u usporedbi sa skupinom PBS, liječenje pcDNA3.1 nije imalo značajan učinak na izlučivanje IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), međutim, Izlučivanje IL-β bilo je značajno povišeno u skupini s cistom G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine i pcDNA3.1- Intramuskularna injekcija alfa-7,3 giardina značajno je povećala razine IL-1β u serumu (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine inducira visoke razine IL -1β sekrecije u skupini koja je primala intramuskularnu injekciju pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .U usporedbi sa svakom skupinom u liječenoj skupini MCC950 i skupini MOCK: (i) razine lučenja IL-1β u kontrolnoj skupini PBS-a i kontrolnoj skupini pcDNA3.1 smanjile su se u određenoj mjeri nakon blokiranja inhibitora MCC950, ali razlika nije značajno (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) nakon blokiranja MCC950., izlučivanje IL-1β bilo je značajno smanjeno u skupini zaraženoj cistom G. duodenalis, skupini pcDNA3.1-alpha-2 giardine i skupini pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, P = 0,0164).Ovi rezultati sugeriraju da alfa-2 giardin i alfa-7.3 giardin posreduju u aktivaciji inflamasoma NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardini aktiviraju NLRP3 inflamasom domaćina in vivo.Miševi su imunizirani (IM) s rekombinantnim eukariotskim ekspresijskim plazmidom pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardinom ili pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardinom i zatim tretirani s MCC950 (ip; MCC950 skupina) ili ne (lažna skupina) ).Skupina za liječenje plazmidom PBS ili pcDNA3.1(+) korištena je kao negativna kontrola, skupina za liječenje ciste G. duodenalis korištena je kao pozitivna kontrola.Eksperimentalna skupina i režim liječenja.b Serumske razine IL-1β kod miševa izmjerene su 7. dana ELISA testom.Razlike između skupina u MOCK skupini analizirane su korištenjem jednosmjerne ANOVA, a razlike između MOCK skupine i MCC950 skupine analizirane su korištenjem t-testa SPSS softvera verzije 22.0.Zvjezdice označavaju značajne razlike između liječenih skupina u MOCK skupini, *P<0,05 i ***P<0,001;znakovi dolara ($) pokazuju značajne razlike između svake skupine u MOCK skupini i MCC950 skupini na P<0,05.Rezultati sedam neovisnih bioloških eksperimenata.i, intramuskularna injekcija, ns, nije značajno (P > 0,05)
Kako bismo istražili učinak alfa-2 i alfa-7.3 giardinom posredovane aktivacije inflammasoma domaćina NLRP3 na infektivnost G. duodenalis, upotrijebili smo WT C57BL/6 miševe i ubrizgali im alfa-2 giardine i alfa-7.3 giardine.plazmid je injiciran intramuskularno, nakon 3 dana kroz želučanu sondu ciste G. duodenalis, nakon čega su miševi promatrani 7 dana.Detaljna shema eksperimenta prikazana je na slici 5a.Tjelesna težina svakog miša je mjerena svaki dan, uzorci svježeg duodenalnog tkiva su uzimani 7. dana nakon primjene kroz želučanu sondu, mjeren je broj trofozoita i promatrane su histopatološke promjene.Kao što je prikazano na slici 5b, s povećanjem vremena hranjenja, BW miševa u svakoj skupini postupno se povećavao.MT miševa počeo je padati 3. dan nakon intragastrične primjene cista G. duodenalis, a zatim se postupno povećavao.Aktivacija inflamasoma NLRP3 inducirana intramuskularnom injekcijom alfa-2 giardina i alfa7.3 giardina značajno je smanjila gubitak težine kod miševa (1. dan: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Dan 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 Dan 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; 2. dan: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 3. dan: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dan 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083; Dan 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dan 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Dan 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dan 5: pcDNA3.1-alpha -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dan 6: pcDNA3 .1 - alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6. dan: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dan 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dan 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parazitsko opterećenje procijenjeno je u dvanaesniku (slika 5c).U usporedbi s netretiranom pozitivnom kontrolom i skupinom kojoj je ubrizgan prazni vektor pcDNA3.1, broj trofozoita G. duodenalis bio je značajno smanjen u skupinama kojima je ubrizgan α-2 giardin i α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha -2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Osim toga, giardine alfa-7.3 bio je bolji zaštitnik kod miševa nego giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Rezultati HE bojenja prikazani su na sl.5d–f.Miševi kojima je ubrizgan alpha-2 giardine i alpha-7.3 giardine imali su manje lezija duodenalnog tkiva, koje su se manifestirale oštećenjem resica, u usporedbi s miševima kojima je ubrizgan G. duodenalis i miševima kojima je ubrizgan G. duodenalis u kombinaciji s praznim pcDNA3 vektorom .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 ili P = 0,0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 ili P = 0,0055) i smanjena atrofija kripti (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 ili P = 0,0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 ili P = 0,0191).Ovi rezultati sugeriraju da alfa-2 giardin i alfa-7,3 giardin smanjuju infektivnost G. duodenalis aktiviranjem NLRP3 inflamasoma in vivo.
Uloga pcDNA3.1(+)-giardina u infekciji G. duodenalis.Miševi su imunizirani (IM) s rekombinantnim eukariotskim ekspresijskim plazmidima pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ili pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine i zatim izazvani G. duodenalis cistama (ig).PBS skupina i pcDNA3.1(+) + skupina za liječenje duodenalne ciste korištene su kao negativne kontrolne skupine, a skupina za liječenje duodenalne ciste korištena je kao pozitivna kontrolna skupina.Eksperimentalna skupina i režim liječenja.b MT miševa u svakoj od različitih tretiranih skupina praćen je 7 dana nakon izlaganja.Zvjezdice označavaju značajne razlike između skupina u skupini G. duodenalis i skupini pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P <0,05, **P <0,01 i ***P <0,001;znak dolara ($) označava značajnu razliku između svake skupine G. duodenalis i skupine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0,01 i $$$P<0,001.c Opterećenje parazitima određeno je brojanjem broja trofozoita u 1 ml duodenalnog ispiranja iz dvanaesnika (dugo 3 cm) i izraženo kao broj parazita po cm duodenuma.Razlike između skupine zaražene G. duodenalis, skupine pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine i skupine pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine analizirane su jednosmjernom ANOVA-om pomoću SPSS softvera verzije 22.0.Zvjezdice označavaju značajne razlike kod **P<0,01 i ***P<0,001.d Histopatološke promjene u duodenumu.Crvene strelice označavaju oštećenje resica, zelene strelice označavaju oštećenje kripti.Mjerna traka: 100 µm.e, f Statistička analiza visine mišjih duodenalnih resica (e) i visine kripte (f).Razlike između skupina na slici 1d analizirane su jednosmjernom ANOVA-om pomoću SPSS softvera verzije 22.0.Zvjezdice označavaju značajne razlike kod *P<0,05 i **P<0,01.Rezultati sedam neovisnih bioloških eksperimenata.ns, nije značajno (P > 0,05)
Giardia duodenum je dobro poznati crijevni parazit ljudi i drugih sisavaca koji uzrokuje giardiasis.Godine 2004. uključena je u Inicijativu zanemarenih bolesti Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) zbog svoje visoke prevalencije tijekom 6 godina, posebno u zajednicama niskog socioekonomskog statusa [32].Urođeni imunološki sustav igra ključnu ulogu u imunološkom odgovoru na infekciju G. duodenalis.Zabilježeno je da mišji makrofagi progutaju i ubiju G. duodenalis otpuštanjem izvanstaničnih zamki [33].Naše prethodne studije su pokazale da G. duodenalis, neinvazivni izvanstanični parazit, aktivira p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 i NLRP3 upalne signalne puteve u mišjim makrofagima za regulaciju upalnih odgovora domaćina, a oslobođeni GEV može poboljšati ovaj proces.13], 24].Međutim, točni PAMP-ovi uključeni u upalu reguliranu NLRP3 inflamasomom u GEV-u i uloga NLRP3 inflamasoma u giardijazi tek treba razjasniti.Kako bismo rasvijetlili ova dva pitanja, proveli smo ovu studiju.
NLRP3 inflamasom se nalazi u citoplazmi imunoloških stanica i mogu ga aktivirati razne čestice kao što su kristali mokraćne kiseline, toksini, bakterije, virusi i paraziti.U bakterijskim studijama, toksini su identificirani kao ključni PAMP-ovi koji aktiviraju upalne senzore, dovodeći do upale i stanične smrti [34].Neki strukturno različiti toksini, poput hemolizina iz Staphylococcus aureus [35] i Escherichia coli [36], hemolizin BL (HBL) iz enterotoksina (NHE) [37], induciraju aktivaciju upale NLRP3.Virusne studije pokazale su da su virulentni proteini kao što su SARS-COV-2 ovojnica (E) protein [38] i Zika virus NS5 protein [39] važni PAMP-ovi koje prepoznaje NLRP3 receptor.U studijama o parazitima, mnogi paraziti su povezani s aktivacijom inflamasoma domaćina, kao što su Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] i Leishmania [42].Proteini gustih granula GRA35, GRA42 i GRA43, povezani s virulencijom Toxoplasma gondii, potrebni su za indukciju piroptoze u Lewisovim makrofagima štakora [43].Osim toga, neke studije Leishmanije usredotočile su se na pojedinačne molekule uključene u upalu NLRP3, kao što je lipofosfoglikan membrane parazita [44] ili cinkova metaloproteaza [45].Među alfa-giardin obiteljima gena sličnih aneksinu, alpha-1 giardin se pokazao potencijalnim kandidatom za cjepivo koje pruža zaštitu protiv G. duodenalis u mišjem modelu [18].U našem istraživanju odabrali smo faktore virulencije G. duodenalis alfa-2 i alfa-7,3 giardine, koji su jedinstveni za giardiju, ali relativno manje prijavljeni.Ova dva ciljana gena klonirana su u vektor pcDNA3.1(+) eukariotskog ekspresijskog sustava za analizu aktivacije upale.
U našem modelu miša, odcijepljeni fragmenti kaspaze služe kao markeri upalne aktivacije.Nakon stimulacije, NLRP3 stupa u interakciju s ASC, regrutira prokaspaze i stvara aktivne kaspaze koje cijepaju pro-IL-1β i pro-IL-18 u zreli IL-1β odnosno IL-18 -18.Upalne kaspaze (kaspaze-1, -4, -5 i -11) su očuvana obitelj cisteinskih proteaza koje su kritične za urođenu obranu i uključene su u upalu i programiranu staničnu smrt [46].Kaspazu-1 aktiviraju kanonski inflamasomi [47], dok se kaspaze-4, -5 i -11 cijepaju tijekom stvaranja atipičnih inflamasoma [48].U ovoj studiji koristili smo mišje peritonealne makrofage kao model i istraživali kaspazu-1 cijepanu p20 kaspazom-1 kao marker upalne aktivacije NLRP3 domaćina u studijama infekcije G. duodenalis.Rezultati su pokazali da su mnogi alfa-giardini odgovorni za tipičnu aktivaciju upale, što je u skladu s otkrićem ključnih virulentnih molekula uključenih u bakterije i viruse.Međutim, naša je studija samo preliminarni pregled i postoje druge molekule koje mogu aktivirati neklasične upale, jer je naša prethodna studija pronašla i klasične i neklasične upale u infekciji G. duodenalis [13].Kako bismo dalje odredili je li generirana p20 kaspaza-1 povezana s NLRP3 inflammasomom, transficirali smo alfa-2 i alfa-7.3 giardine u mišje peritonealne makrofage kako bismo odredili razine ekspresije proteina ključne molekule i razine oligomerizacije ASC, potvrđujući da oba α-giardina aktiviraju inflamasomski NLRP3.Naši rezultati malo se razlikuju od onih Manko-Prykhoda i sur., koji su izvijestili da stimulacija stanica Caco-2 samo sojevima G. muris ili E. coli EPEC može povećati intenzitet fluorescencije NLRP3, ASC i kaspaze-1, iako ne značajno, dok je kostimulacija G. muris i E. coli povećala razine triju proteina [49].Ova razlika može biti posljedica razlika u odabiru vrsta Giardia, staničnih linija i primarnih stanica.Također smo izvršili in vivo testove koristeći MCC950 u 5 tjedana starih ženki miševa WT C57BL/6, koje su osjetljivije na G. duodenalis.MCC950 je snažan i selektivan inhibitor NLRP3 male molekule koji blokira kanoničku i nekanoničku aktivaciju NLRP3 u nanomolarnim koncentracijama.MCC950 inhibira aktivaciju NLRP3, ali ne utječe na aktivaciju upalnih puteva AIM2, NLRC4 i NLRP1 ili signalnih putova TLR [27].MCC950 blokira aktivaciju NLRP3, ali ne inhibira inicijaciju NLRP3, efluks K+, influks Ca2+ ili interakciju između NLRP3 i ASC;umjesto toga, inhibira aktivaciju inflamasoma NLRP3 blokiranjem oligomerizacije ASC [27].Stoga smo upotrijebili MCC950 u in vivo studiji kako bismo odredili ulogu inflamasoma NLRP3 nakon injekcije giardina.Aktivirana kaspaza-1 p10 cijepa proupalne citokine pro-IL-1β i pro-IL-18 u zrele IL-1β i IL-18 [50].U ovoj studiji, razine IL-1β u serumu u miševa tretiranih giardinom sa ili bez MCC950 korištene su kao pokazatelj je li inflamasom NLRP3 aktiviran.Kao što se očekivalo, liječenje MCC950 značajno je smanjilo razine IL-1β u serumu.Ovi podaci jasno pokazuju da G. duodenalis giardin alfa-2 i giardin alfa-7.3 mogu aktivirati NLRP3 mišji inflamasom.
Značajni podaci prikupljeni tijekom prošlog desetljeća pokazali su da je IL-17A glavni regulator imuniteta protiv G. muris, inducirajući signalizaciju IL-17RA, proizvodeći antimikrobne peptide i regulirajući aktivaciju komplementa [51].Međutim, infekcija Giardia se češće javlja kod mladih odraslih osoba, a objavljeno je da infekcija Giardia u mladih miševa ne aktivira odgovor IL-17A kako bi izvršio svoj zaštitni učinak [52], što je potaknulo istraživače da potraže druge imunomodulatorne Giardije.mehanizmi infekcije helmintima.Autori nedavne studije izvijestili su da G. muris može aktivirati inflammasom NLRP3 pomoću E. coli EPEC, što potiče proizvodnju antimikrobnih peptida i smanjuje njihovu sposobnost pričvršćivanja i broj trofozoita u probavnom traktu, čime se smanjuje težina debelog crijeva bolesti uzrokovane bacilima [49].Inflamasom NLRP3 uključen je u razvoj raznih bolesti.Studije su pokazale da Pseudomonas aeruginosa pokreće autofagiju u makrofagima kako bi se izbjegla stanična smrt, a taj proces ovisi o aktivaciji inflamasoma NLRP3 [53].Za N. caninum, aktivacija inflamasoma NLRP3 posredovana reaktivnim vrstama kisika ograničava njegovu replikaciju u domaćinu, čineći ga potencijalnom terapeutskom metom [9].Utvrđeno je da Paracoccidioides brasiliensis inducira aktivaciju inflamasoma NLRP3 u dendritskim stanicama dobivenim iz koštane srži miša, što rezultira otpuštanjem upalnog citokina IL-1β, koji ima ključnu ulogu u obrani domaćina [10].Nekoliko vrsta Leishmania, uključujući L. amazonensis, L. major, L. braziliensis i L. infantum chagasi, aktiviraju NLRP3 i ASC-ovisnu kaspazu-1 u makrofagima, kao i infekciju Leishmanijom.Replikacija parazita je pojačana kod miševa s nedostatkom gena NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni i sur.Zabilježeno je da infekcija leishmanijom inducira aktivaciju inflamasoma NLRP3 u makrofagima, što ograničava unutarstaničnu replikaciju parazita.Stoga, Leishmania može inhibirati aktivaciju NLRP3 kao strategiju izbjegavanja.U studijama in vivo, inflamasom NLRP3 pridonio je eliminaciji leishmanije, ali nije utjecao na tkiva [54].Nasuprot tome, u studijama helmintijaze, aktivacija inflamasoma NLRP3 potisnula je zaštitni imunitet domaćina protiv gastrointestinalnih helmintijaza [12].Shigella je jedna od glavnih bakterija koje uzrokuju proljev u cijelom svijetu.Ove bakterije mogu inducirati proizvodnju IL-1β putem efluksa K+ posredovanog receptorom P2X7, reaktivnih vrsta kisika, lizosomalne acidifikacije i oštećenja mitohondrija.NLRP3 inflamasom negativno regulira fagocitozu i baktericidnu aktivnost makrofaga protiv Shigella [55].Studije plazmodija pokazale su da AIM2, NLRP3 ili miševi s nedostatkom kaspaze-1 zaraženi plazmodijem proizvode visoke razine interferona tipa 1 i otporniji su na infekciju plazmodijem [56].Međutim, uloga alfa-2 giardina i alfa-7.3 giardina u induciranju patogene aktivacije upale NLRP3 kod miševa nije jasna.
U ovoj studiji, inhibicija upale NLRP3 pomoću MCC950 smanjila je BW i povećala broj trofozoita u intestinalnoj lavažnoj tekućini kod miševa, što je rezultiralo težim patološkim promjenama u duodenalnom tkivu.Alpha-2 giardine i alpha-7.3 giardine aktiviraju upalu NLRP3 miša domaćina, povećavaju tjelesnu težinu miša, smanjuju broj trofozoita u tekućini za ispiranje crijeva i ublažavaju patološke duodenalne lezije.Ovi rezultati sugeriraju da G. duodenalis može aktivirati NLRP3 inflammasom domaćina putem alfa-2 giardina i alfa-7,3 giardina, smanjujući patogenost G. duodenalis u miševa.
Zajedno, naši rezultati pokazuju da alfa-2 i alfa-7.3 giardine induciraju aktivaciju inflammasoma domaćina NLRP3 i smanjuju infektivnost G. duodenalis u miševa.Stoga su ove molekule obećavajuće mete za prevenciju giardijaze.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: pregled.Nedavno je otkriveno da je Pat Inflamm alergičan na lijekove.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: pregled farmakoterapije.Stručno mišljenje farmaceuta.2007.;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, otpornost na lijekove i otkrivanje novih meta.Inficira mete droge Disord.2010;10:295-302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, itd. NLRP3 inflammasome i upalne bolesti.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Uloga inflammasoma u intestinalnim upalama i raku.Gastroenterologija.2011.;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical and atypical NLRP3 inflammasome activation at the crossroad of immune tolerance and gut upale.preimuni.2017; 8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.Aktivacija inflamasoma NLRP3 posredovana ROS-om uključena je u odgovor na infekciju N. caninum.Vektor parazita.2020;13:449.